替硝唑在蜂蜜中残留量的检测方法和停药安全期的研究

吴 格 陈圣崴 陈 明

摘要蜂蜜中替硝唑药物使用的停药安全期和残留量的高效液相色谱检测方法的试验研究结果表明,替硝唑浓度在0.05～2.50μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为93.4%~99.1%,相对标准偏差为1.27%~5.31%,最低检测限为0.01μg/mL。该方法简便、快速、准确。替硝唑施药浓度为2.0g/L时,停药安全期是15d以上;施用浓度5.0g/L时,停药安全期是25d以上。

关键词蜂蜜;替硝唑;残留量;高效液相色谱;停药安全期

中图分类号S859.84 ;S896.8 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)21-0287-03

我国蜂产品年产量及出口量均居世界前列。但由于蜂产品中农兽药物残留超标,出口屡屡受阻。进口国纷纷采取了封关、扣留及销毁产品等措施。给我国养蜂业造成巨大影响。近几年,中国加强了对蜂产品中药物残留的控制管理。虽然目前欧盟等国有限度解除了对中国蜂产品的进口禁令,但它对进口的蜂产品质量标准不断提高,其中的禁用药物种类逐年增加。因此,为了应对国外的“绿色壁垒”,也为了提高我国蜂产品的产品质量,要加强蜂产品中药物残留研究工作的技术储备,迅速提高自身水平,主动适应国际间对此类产品日益提高的质量标准要求。

南京外国语学校科研实习小组在饲养蜜蜂的观察研究试验中,了解到蜜蜂爬蜂病是我国近年来西方蜜蜂普遍发生的疾病,秋冬两季尤为严重,患病蜜蜂轻者群势迅速削弱,重者全群覆灭,给蜂农带来巨大损失。以前蜜蜂爬蜂病主要使用氯霉素、甲硝唑治疗,在国家明令禁止在农业生产中使用氯霉素、洛硝达唑等药,欧盟又禁用甲硝唑后,没有列为禁药的替硝唑成为治疗爬蜂病的主要药物。替硝唑(Tinidazole)别名磺甲硝咪唑(Fasigyn),是一种人工合成的抗生素,属于硝基咪唑类药物,具有抗厌氧菌和抗原虫的作用。它单独使用或和其他药物配合使用,对防治各种蜂病都有一定疗效,因此目前在我国养蜂业生产中广泛应用。我国和欧盟、日本、美国对抗生素药物在动物源食品中的使用及残留都有相应的规定,但对于取代氯霉素、甲硝唑成为防治蜜蜂爬蜂病主要药物之一的替硝唑,我国目前还没有关于蜂蜜中替硝唑残留量测定的国家、行业或地方检测方法标准,也没有相应的药物使用规范。蜂农经常根据经验自行添加使用,也没有相应的停药安全期。往往造成蜂产品中药物残留超标,影响蜂蜜产品品质。

目前国内外对替硝唑分析检测方法,主要有紫外分光光度法、荧光分光光度法、酶联法、液相色谱法、火焰原子吸收光谱法、胶束薄层法等。多出现在对替硝唑原料药和成药的检测,以及药物在人体中的药物动力学和药物代谢检测研究。笔者采用高效液相色谱法检测蜂蜜中替硝唑的残留量,样品经溶剂提取、离心沉淀、净化、浓缩。在C18色谱柱上分离,紫外检测器测定,可以一次性定性定量检测蜂蜜中替硝唑的药物残留量,方法简单快捷,为研究替硝唑在蜂蜜中的药物残留消减规律提供了技术依据。该试验研究了在饲养蜜蜂过程中,当施用不同浓度的替硝唑药液后,蜂蜜中替硝唑残留量的消减规律。初步确定不同替硝唑施药浓度的停药安全期。

1材料与方法

1.1仪器设备、药品及试剂

Agilent1100S高效液相色谱仪(美国,Agilent公司),配备四元泵,二极管矩阵检测器(DAD);Lamda25紫外分光光度计(美国,PE公司);N-EVEP 112氮吹仪(美国,Organom ation Associates公司);Milli-Q超纯水器 (美国,MILLLIPORE公司)等。

替硝唑标准品:≥99.5%(Sigma公司产品);所用试剂磷酸氢二钾、乙酸乙酯、盐酸等为分析纯,甲醇为色谱纯,水为超纯水。

1.2各种溶液的配制

替硝唑标准储备液:准确称取替硝唑标准品0.100 0g,用甲醇溶解,定容至100mL棕色容量瓶,此替硝唑标准储备液浓度为1mg/mL。放置4℃冰箱中保存,可以使用2个月。

标准工作液:吸取适量的标准储备液,用甲醇∶水(20/80;V/V)溶液稀释至所需的质量浓度。置于4℃条件下避光保存,有效期为20d。

1.3色谱检测条件

高效液相色谱仪配备二极管矩阵检测器,检测波长316nm;色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm,i.d,5μm),柱温25℃;流动相:甲醇+水=20+80;流速1.0 mL/min,样品进样量为20μL。

1.4试验方法

将替硝唑原药用水配制成2.0g/L、5.0g/L 2种浓度的溶液,对无药物污染的新蜂巢脾板分别进行喷雾施药后,放入2个不同的蜂箱,替换出旧的脾板。然后每天施药1次,共计3d。停药后第3天、第8天、第15天、第25天采集脾板上的蜂蜜,检测其替硝唑药物残留含量。

1.5样品处理

准确称取10.0g(精确至0.001g)混匀的蜂蜜,放入50mL离心管,加入10mL超纯水,振荡溶解。加入磷酸氢二钾5g,漩涡振荡5min使其溶解。加入10mL乙酸乙酯萃取,漩涡振荡5min,高速离心(10 000rpm)5min。吸取上层有机相;分别用8mL、4mL乙酸乙酯重复萃取操作步骤2次。将3次有机相合并后使用氮气吹干仪在40℃水浴下吹干,用1mL的20%甲醇水溶液溶解定容,用0.22μm针式滤器过滤,最后用高效液相色谱仪测定。

样品加标试验:称取空白样品后,加入适量浓度的替硝唑标准溶液,其他处理步骤同上。

2结果与分析

2.1色谱分析条件

2.1.1检测波长的选择。用紫外可见分光光度计对替硝唑标准品溶液进行全波长扫描(190～600nm),检测波长选择试验结果表明,替硝唑在190～600nm范围内最大吸收峰在316nm处。因此,选择高效液相色谱仪二极管矩阵检测器(DAD),检测波长为316nm,同时可以避免低波长紫外下杂质干扰检测。

2.1.2流动相对替硝唑分离的影响。在高效液相色谱的分析中,流动相中甲醇浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%变化时,替硝唑在C18反相分析柱上的保留时间变短。甲醇浓度太低,分析时间延长,替硝唑峰形变宽拖尾;甲醇浓度太高,分析时间太短,样品中干扰物质和替硝唑的分离不好。经过试验,甲醇浓度以20%为宜。

2.1.3温度对保留时间的影响。研究发现,不同的分析柱温会使替硝唑色谱图出峰保留时间变化,实验室环境温度变化也是干扰色谱分析条件的因素之一,影响分离效果和检测准确性,应该引起试验测试者足够重视。因此,该试验建议分析检测方法,分析柱温设定为25℃,液相色谱仪器实验室温度也应控制在恒温条件下开展(23~25℃)。

2.2标准工作曲线及检出限

准确吸取一定体积的替硝唑标准储备液,用20%甲醇水溶液逐级稀释,分别配制成浓度为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL、1.60μg/mL、2.50μg/mL的替硝唑标准工作液,此溶液现配现用。按上述的色谱分析条件,每个浓度测定3次,取测得的峰面积平均值和替硝唑的浓度关系作线性回归分析,结果表明:替硝唑质量浓度(C)在0.05～2.50μg/mL范围内与峰面积(A)呈良好的线性关系,线性回归方程为:C=0.028 8A-0.001 89,相关系数r2=0.999 8。

在药物残留的检测中,检测限是主要的技术指标之一。是考察检测替硝唑残留量的最低浓度有效值。以3倍于噪音峰高的替硝唑浓度响应值作为最低检测限,该分析条件下替硝唑的最低检测限为0.01μg/mL。

2.3样品前处理方法

高效液相色谱分析,需要对样品进行一定的处理和净化、富集。以减少杂质对分离检测时的干扰和提高药物残留的检测限。因此,需要研究样品的前处理条件,以净化除去可能会干扰检测的样品基质中杂质。液液萃取法是化学分析中常用的分离方法,目前国内外有关硝基咪唑类药物分析样品前处理使用最广的提取溶剂一般有乙酸乙酯、乙腈、甲苯和二氯甲烷。二氯甲烷毒性较大;而通常情况下,乙腈与水相互溶,不便于进一步分离提取目标物。因此,选择采用乙酸乙酯作为蜂蜜中替硝唑的萃取溶剂。通过振荡、超声、高速离心的方法进行提取分离。

蜂蜜样品在添加水溶解后直接用乙酸乙酯提取,发现高速离心后,两相液面有较厚的乳化层,影响萃取分离。当添加一定的磷酸氢二钾盐后,乳化层减弱。为了研究添加磷酸盐对液液萃取效率的影响,试验设计了2g、5g、10g等3种添加量。考察了对方法回收率高低的影响。根据试验结果(见表1),建议采用添加5g磷酸氢二钾。

2.4回收率

在上述色谱条件下,分别在未含替硝唑药物残留的空白蜂蜜样品中,添加0.01mg/kg、0.04mg/kg、0.16mg/kg 3个浓度水平的替硝唑标准品。每个浓度水平做3个重复。测得蜂蜜中替硝唑的平均回收率为93.4%~99.1%,相对标准偏差为1.27%~5.31%。表明该方法准确度和精确度能满足蜂蜜中替硝唑残留的分析要求(见图1、图2)。

2.5停药安全期

将采集的蜂蜜样品按确定的试验条件处理并通过高效液相色谱分析检测,结果见表2、表3。

从试验结果可以初步看出,施用替硝唑后,蜂蜜中替硝唑的浓度含量随着时间逐渐消减。2.0g/L浓度的替硝唑原药施用后,在15d后蜂蜜中的替硝唑残留量消减到不能检出,而5.0g/L浓度的替硝唑原药施用后,到第25天蜂蜜中替硝唑残留量消减到不能检出。因此,可以初步确定当替硝唑的施药浓度是2.0g/L时,停药的安全期是15d以上。而当施用5.0g/L浓度的替硝唑药液时,停药的安全期是25d以上。

3结论与讨论

试验建立了蜂蜜中替硝唑药物残留的高效液相色谱检测方法和样品分离、纯化、富集的前处理方法。检测中基本无杂质干扰检测,样品峰分离效果好,具有特异性强、灵敏度高等优点。替硝唑浓度在0.05～2.50μg/mL范围内时,浓度与峰面积呈良好的线性关系。在空白样品中添加替硝唑浓度为0.01mg/kg、0.04mg/kg、0.16mg/kg时,替硝唑的平均回收率为93.4%~99.1%,相对标准偏差为1.27%~5.31%。符合残留检测要求。检验过程样品处理步骤简单,分析时间短,结果稳定、准确、可靠,可满足对蜂蜜中替硝唑药物残留量的检测。替硝唑的药物施用试验,初步探讨了该药物在防治蜂病时的药物施用浓度和停药安全期,为加强蜂产品的药物使用监管和残留监测,保证蜂产品质量提供一定的技术依据,能够提高我国蜂产品的出口竞争力,从而使我国的蜜蜂产业突破国外的“技术壁垒”,顺利地跨出国门,走向世界。

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