植物线粒体中活性氧的产生与抗氧化系统

孙海平 汪晓峰

摘要活细胞中活性氧不仅在信号转导方面起着关键作用,而且还可以对生物大分子起到伤害作用,所以线粒体中的活性氧必须控制在一定的浓度。植物线粒体中存在几种抗氧化系统,它们可以控制活性氧的产生,修补活性氧对大分子造成的损伤。其中抗氧化系统包括依赖于抗坏血酸分子和谷胱甘肽分子途径的,依赖硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)分子 和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxudase,GPX)途径的。综述了线粒体中控制活性氧的各种氧化还原反应途径,并特别强调指出,TRX 和GPX系统,以期能给该方面的研究提供帮助。

关键字线粒体;活性氧;抗氧化系统

中图分类号Q945.1文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)08-0239-02

需氧进行光合作用的生物是在大气中氧存在的情况下出现和进化的,陆生植物也是在大气中氧存在的情况下出现和进化的,结果陆生植物形成了不仅可以极大运用氧气的能力,而且也形成了能限制活性氧不良作用的新陈代谢方式。单线态氧(1O2)、超氧负离子(O2-)、过氧化物和过氧化氢的氧代谢均可以产生活性氧。一方面,由于这些氧化物的有害性,植物需要控制它们在细胞中的含量;另一方面,当植物体遭遇病原体入侵时,活性氧可以作为信号分子起作用。同时,这些分子能使蛋白质发生变化,诱导基因转录。这种信号系统是细胞与外环境通信的重要组成部分。

在植物细胞中,叶绿体、线粒体和过氧化物体是产生活性氧的部位,由于活性氧可以通过细胞空隙自由扩散进入线粒体,所以线粒体成为活性氧伤害的主要细胞器[1-6]。最近研究表明,线粒体在信号转导中处于十分重要的地位。

1植物线粒体中活性氧的产生和性质

在线粒体的电子传递过程中,电子沿着一系列的电子传递体传递到末端氧化酶,然后再传递给氧,最后质子与离子型氧结合生成水。但是,位于呼吸链底物端的一些物质,如黄素蛋白、非血红素铁蛋白(non-heme iron proteins)、醌(qu-inols),尤其是半醌(semiquinols)等发生氧化还原的能障(en-ergy barier)是很低的,常常直接启动O2的单电子还原(one-electron reduction),产生O2-。在电子传递给末端氧化酶之前漏出呼吸链与氧反应生成超氧自由基的过程是线粒体产生ROS的主要来源。一些酶系统通过细胞色素C氧化酶和交替氧化酶(alternative oxidase,AOX)还原氧分子。在动物线粒体中黄素单核苷酸(FMN)和复合物Ⅰ中NADH脱氢酶的铁硫中心是超氧阴离子产生的部位。复合物Ⅰ不仅能增加活性氧的含量,也能控制活性氧在整个细胞中的浓度;但复合物Ⅰ对泛醌即辅酶Q的过度还原会产生相反的作用,即形成大量的活性氧。在复合物Ⅲ中过度的还原也会产生大量的超氧化物阴离子(O2-)。

大部分超氧阴离子(O2-)在Mn-SOD的作用下可以有效地转变成过氧化氢,然后过氧化氢与铁或铜离子反应生成OH。铁硫蛋白也可通过释放铁离子进行同样的反应。同时,高分子和大分子成为其他活性氧攻击的目标,例如,在膜脂或线粒体DNA合成过程中起作用:线粒体中的染色体是以染色质的形式存在,同时DNA修复的低频率性使线粒体DNA比核DNA更易受到氧化损伤。恶劣的外界环境条件同样会使植物体遭受氧胁迫,例如,病原体入侵,细胞凋亡,盐胁迫以及大量金属离子的累积都可以导致活性氧的形成。尽管活性氧使线粒体代谢失衡,但是它们构成了细胞内的信号通路,特别在细胞核DNA转录调控中起到了很大作用。

2线粒体蛋白组分析

线粒体中的生物系统与细胞质和叶绿体中的生物系统具有相似性,但植物线粒体也有自己独特的特征。大规模蛋白质组学研究已经完成,该研究旨在阐明各细胞器中生物系统进化是否有相关性,特别是当处于胁迫情况下时它们之间的相关性[6,7]。许多线粒体蛋白被认为是过氧化酶的靶分子,并且一些蛋白以氧化的形式存在[8,9]。当氧化发生在半胱氨酸和甲硫氨酸时,氧化可以可逆的影响酶的活性,而且以此方式参与信号通路。当氧化发生在其他氨基酸时,肽链就会断裂并且对蛋白酶的攻击也就加强,这样就会影响线粒体代谢。当蛋白质遭受氧化损伤时,在线粒体的提取物中可以发现蛋白质断裂后的产物,同时线粒体中的多种蛋白质也会发生改变。在氧化胁迫情况下,三羧酸循环中的酶和含Fe-S聚簇的酶很可能是第1个作为氧化的靶分子遭受氧化损伤[10]。

3线粒体能量释放系统

交替氧化酶(AOX)和解偶联蛋白(UCP)是线粒体中2种能量释放系统,它们由多基因家族编码,具有不同的表达和调控方式。线粒体膜蛋白之间良好的协调关系将有助于它们减少由于电子传递链过度还原产生的活性氧。它们的调控很可能会影响三羧酸循环过程[11,12]。由于对AOXs和UCPs多样性研究的逐渐增多,植物线粒体中它们的不同功能在不久的将来可能出现。它们在线粒体产生的氧化胁迫上能起到很好的保护作用,但不能阻止伤害的产生。

4抗坏血酸

抗坏血酸是一种小分子的抗氧化物,在植物细胞中具有很高的浓度,具有很强的抗氧化能力,通常浓度在10~100mg/L之间,但在特殊的情况下,浓度可高达300mg/L。因此,抗坏血酸在细胞氧化还原反应和代谢调控上起到了很突出的作用。抗坏血酸在线粒体以及细胞的其他部位均存在,浓度相当,但在叶绿体中的含量较多。而且与在其他细胞器中一样,在线粒体中以还原态存在。现已经证实抗坏血酸-谷胱甘肽循环在线粒体中的存在,并且可以调节自身内部过氧化氢的浓度,其中谷胱甘肽(glutathione,GSH)、抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydro-ascorbate reductase,DHAR)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)均存在于线粒体基质中,单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)则存在于线粒体膜上[13,14]。抗坏血酸进入线粒体的形式至今没有得到证实。但需要注意的是催化合成抗血酸的酶定位于线粒体内膜上(Bartoli et al.,2000)。在线粒体的膜间隙中抗坏血酸合成,被氧化后进入基质中,进入循环后被还原,接着在APX催化下还原型的抗坏血酸将过氧化氢还原成水,同时ASA变成DHA;DHA通过循环,在2分子GSH作用下被还原成ASA,同时GSH被氧化成GSSG。

5酶促ROS清除系统

5.1SOD和过氧化氢酶(catalase)

线粒体基质中含有Mn-SOD,它催化超氧阴离子自由基还原成过氧化氢,同时Mn-SOD也保护着基质中可溶性酶被超氧阴离子氧化。但是生成的过氧化氢的清除机制仍不是很清楚。

5.2GSH和硫氧还蛋白(TRX)的线粒体系统

GSH在线粒体基质中的浓度高达107 。在线粒体脊发现了GSH还原酶,但是人们仍然认为GSH合成通路不存在于线粒体中。在细胞器之间的间隙存在GSH存储池,不同的载体可以从细胞溶质中吸收GSH来维持GSH的含量。GSH可以保护蛋白免受氧化损伤。GSH的不可逆内收保护了半胱氨酸免受过氧化的损伤。由于谷胱甘肽化的蛋白质没有活性,因此,谷胱甘肽化的蛋白质成为氧化胁迫的一种调节方式。在动物线粒体中,GRX调节谷胱甘肽化和非谷胱甘肽化。目前,GRX在植物线粒体中还没有被正式认定,但是几种序列都支持线粒体的转运肽,而且可能这些蛋白质现在存在于线粒体中[15]。

5.3GRX和TRX在线粒体中的靶分子

随着植物中GRX和TRX系统的发现,对它们作用对象的寻找和分析以及它们在器官和分子水平上的作用成为日益关注的问题。TRX系统不仅与在细胞的组成物中发现的物质具有相似性,而且还与一组特殊的线粒体酶相互作用。由于半胱氨酸标记方法,单半胱氨酸GRX和TRX突变体的应用,双向电泳和荧光探针,使它们得到了证实。对分离多肽的光谱测定,鉴定了GRX和TRX的靶分子。TRX很可能以多种方式调节着很多种线粒体酶。在不同的靶分子中,区别酶分子的不同是可能的,此需要TRX具有催化作用和再生功能,最重要的是具有氧化还原酶和底物酶。

第1类不依赖TRX的酶有:过氧化物还原酶(peroxi-redoxins,PRXs)、核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase)、蛋氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase,MSR)、植物的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GRXs)。MSR存在于人类的线粒体中,而在植物中至今没有发现。PRX几乎存在于所有细胞中。植物的PRX通常有4种类型,即PRXⅡ、2-CysPRX、1-CysPRX和PRXQ,其中PRXⅡ是最大的一种,从生物体和细胞水平上考虑,GSH或GRX或TRX均可以单独还原PRXⅡ;2-CysPRX存在于哺乳动物组织细胞的线粒体中,但在植物中却没有报道。除了上述的4种类型外,最近又发现了第5种不依赖TRX的过氧化物酶,它属于GPX蛋白;在植物中GPX蛋白很可能与TRX作用而不与GSH作用,并且从序列分析得知,植物线粒体中至少含有它的1种异构体。通过绿色荧光蛋白融合技术,在活体外部观察到了GPX存在于线粒体中,是细胞质或叶绿体的TRX还原了线粒体的电子供体而不是线粒体本身的TRX还原的[14,15]。这样,就像其他细胞中的一样,PRX家族和其伴侣在线粒体中形成了一个很复杂的网络结构,以调控不同环境中ROS的浓度变化;另外,它们很可能在氧化还原和信号转导上起作用,还需要进一步研究。

线粒体中有一类可以被TRX调控的蛋白质,这些蛋白质作为TRX的靶分子,其存在于许多代谢过程中,包括柠檬酸循环、光呼吸作用、脂肪酸代谢、激素调节过程、硫或氮代谢、转运调控和蛋白组装上。PCD中的与渗透性转变小孔形成有关的阴离子通道载体是最有意义的靶分子,但是研究最多的靶分子是AOX。在电子传递链上,AOX是一种铁蛋白,催化氧气还原为水,同时泛醌被氧化,但是不形成三磷酸腺苷。当线粒体处于胁迫时,AOX可以阻止泛醌的过度还原,减少超氧阴离子自由基的产生和氧化胁迫。AOX以2分子复合物的形式存在,锚定于线粒体内膜,有保守的半胱氨酸,当2个半胱氨酸被氧化形成二硫键,发生二聚化,即酶失活[14,15]。以上这些都说明,在线粒体基质中,存在一个交叉点,可以将TRX调控系统和ETC的氧化还原状态与线粒体膜联系起来。

6结束语

由于科学的进步和新的实验方法的出现,使得人们对线粒体的认识正在逐步深入。这些都归于从不同植物,甚至从模式植物中纯化线粒体方法的提高,在蛋白质组学的研究上也出现了新的方法。因此,对线粒体中各种代谢途径与抗氧化关系的研究将是以后研究的方向。

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