论狂犬病疫苗的研究进展

王根龙　成建忠

摘要 概述了狂犬病疫苗的研究进展，以期为合理应用疫苗及了解其发展趋势提供参考。

关键词 狂犬病；传统疫苗；细胞疫苗；新型疫苗；研究进展

中图分类号 R512.9903 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）05-0223-02

1 传统疫苗

1885年巴斯德尝试用感染狂犬病毒固定毒的兔脊髓并于室温干燥，经此制备的疫苗试验后在1885年首次应用于人并获得了成功。1908年Fermi通过在室温下用1%酚处理组织改进了巴斯德的方法。1911年Semple 应用羊脑组织的匀浆物制备疫苗，提高了疫苗的易感性。应用化学方法如酚、β－丙内脂制备了无毒性的Semple 疫苗。我国自1949年起，一直使用由山羊脑组织制备的Semple 疫苗，直到1980年停止使用，由原代地鼠肾细胞和BHK细胞疫苗取代。脑组织疫苗由于注射量大（每针2mL），接种次数多（14针以上），接种后易引起神经变态反应，抗体产生慢而且水平低等原因，WHO狂犬病专家委员会在第七次报告（1984年）中支持限制和放弃生产脑组织疫苗，并极力提倡使用灭活的细胞培养疫苗。

2 细胞疫苗

2.1 人二倍体细胞疫苗（HDCV）

1964年Wiktor在Wistar研究所首次描述HDCV，并进一步通过比较试验最终将来源于Semple疫苗生产用PM狂犬病毒株适应到W1～38人二倍体细胞株（后来又适应到MRC 5细胞）。该疫苗于1974年首次获准生产，并于1978年开始商品化。HDCV不含任何神经毒因子，并不含任何外源动物杂质，因而可以解释它在重复注射后较好的耐受。采用NIH法检测疫苗的稳定性证实，疫苗在4℃和37℃放置1个月后，无明显差异。进一步将5批效价为4.3～5.6的疫苗4℃存放3.5年，所有批号滴度均大于2.5IU/剂。早期调查发现，HDCV预防接种后1个月或3个月达到抗体峰值（10IU左右），随后便逐渐降低，但1～2年内滴度始终大于0.5IU，通过1～3年内加强免疫后，抗体滴度迅速增加10～15倍，肌肉注射和皮下注射途径相近。

人二倍体细胞（HDC）为正常核型细胞，无致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫原性和良好的耐受性，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用，这使其成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗[1]。HDCV的缺点在于HDC不太容易培养，而且狂犬病毒在HDC上培养的病毒滴度相对较低，仅能在空间有限的细胞瓶内培养，这使得疫苗的价格非常昂贵。在美国，用HDCV暴露后处理一个疗程费用高达1 000多美元；而在巴基斯坦，用羊脑组织苗（SemPle疫苗）进行全疗程处理只需2.5美元，这样就限制了该疫苗在发展中国家的使用。

2.2 原代细胞培养疫苗

用地鼠肾细胞组织培养狂犬病毒发展灭活疫苗首先由Kissling提出并由Fenje进一步发展，将SAD狂犬病毒固定毒适应到地鼠肾细胞（PHKC）上生产灭活的疫苗，并获得成功。1968年该疫苗在加拿大批准用于人体加强和暴露前接种。

我国的PHKCV由卫生部武汉生物制品研究所林放涛领导的小组研制而成。试验开始所用毒种为北京株兔脑固定毒，经“混合细胞培养法”在PHKC上适应，连续传50～60代适应成功；再经豚鼠脑和PHKC交替3次传代的毒株称为aG株。aG株病毒在PHKC上培养收获，福尔马林灭活，加Al（OH）3佐剂。疫苗规定效价为1.3～2.5IU，经超滤浓缩后，浓缩疫苗效价需＞2.5IU。经临床试验证明，各种剂型的PHKCV在人体中的抗体反应均优于羊脑Semple疫苗。目前，原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗（PHKC－RV）在我国、原苏联及部分东欧国家使用。我国的PHKC－RV使用量大，占全世界所有各种细胞疫苗总使用量约80%，其有效性已被大量实验室与临床观察结果充分证实，并受到国外学者的首肯。我国的PHKC－RV有佐剂疫苗、佐剂浓缩疫苗与冻干浓缩疫苗3种，均已纳入国家规程。为尽量减少可能出现的副作用，少量生产的浓缩疫苗宜进行精制。

Van Wezal等1978年使用狂犬病毒PM株适应到狗肾细胞，并使用了微载体以使疫苗大规模生产。疫苗对暴露前后的人体接种试验在荷兰进行，获得的免疫反应和HKCV具可比性，并于1980年获准在荷兰生产。狂犬病毒PU11株在牛肾原代细胞上培养31代作为毒种，用胎牛肾原代细胞培养收获病毒，经灭活、浓缩、纯化后制作的牛肾细胞疫苗，抗体效价达5～25IU，采用6针法免疫，该疫苗已在法国批准用于暴露前和暴露后预防接种[2]。1983年Barth等从日本疫苗分化出一种用Flary LEP株适应到鸡胚细胞上的纯化鸡胚细胞疫苗（PCECV）。培养病毒采用β－丙内酯灭活，并经蔗糖梯度区带离心纯化和浓缩。该疫苗目前由德国Chiro Behring GmbH公司生产。人体暴露前后的临床试验结果表明，疫苗的免疫效果和HDCV相当，并且不会诱生针对鸡细胞蛋白的抗体，使用该疫苗仅产生轻微的局部反应。

2.3 传代细胞系疫苗

2.3.1 非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）疫苗。1984年由法国Merieun研究所研制成功。制备过程中采用了使细胞贴附在微载体上悬浮培养的微载体技术以便进行工业化大罐培养。该疫苗使用的病毒株与HDCV相同，为PM1503-3M。收获的病毒经超滤浓缩、密度梯度离心β-丙内酯灭活制成冻干疫苗。早期研究证实，在100个接种的试验动物体内没有病毒转移，每剂疫苗的残余细胞DNA量小于50pg，疫苗的稳定性极好，与HDCV相似。大量试验证实无论用作暴露前人体免疫或暴露后处理，Vero疫苗均获得了很好的免疫效果。由于Vero细胞较HDC能生产较高的狂犬病毒滴度，并可利用微载体技术进行工业化大罐培养，因而其价格较HDCV便宜。但是用Vero细胞制备疫苗需在低细胞代数使用以确保无致瘤性，且残余细胞DNA量需小于100pg/剂。我国从1995年开始进行色谱纯化的人用Vero细胞疫苗的研制。制备过程中使用的病毒株是适应到Vero细胞的狂犬病毒CTN-1。目前已有包括卫生部上海生物制品研究所在内的多家生物制品研究所研制成功，并获得生产文号，以逐步取代我国现行的地鼠肾细胞疫苗。

2.3.2 幼仓鼠肾细胞（BHK细胞）疫苗。早在20世纪70年代就有利用悬浮生长的BHK细胞感染Flary LEP株病毒生产灭活的兽用狂犬疫苗的报道。进入90年代后，法国巴斯德研究所将生物反应器应用到BHK细胞悬浮培养，制备1种试验狂犬病疫苗。制备时使用了1种PV Paris/BHK21狂犬病毒适应株，并采用了1种新的无血清培养基，这种试验疫苗在小鼠体内获得了满意的保护活力。他们进一步使用这种简单的BHK狂犬病疫苗在人类志愿者中进行了初步试验，证实该疫苗有好的免疫原性和耐受性。注射给地鼠后完整的BHK细胞是致瘤的，但当以病毒灭活的浓度用β－丙内酯处理细胞后，这种肿瘤原性便被除掉。另外，通过现有的纯化技术，残余的细胞DNA可降到最低量。BHK细胞是狂犬病毒的高产细胞，并可在生物反应器中大规模培养，这一途径有助于那些希望开始制备细胞疫苗的发展中国家生产兽用和人用狂犬病疫苗。

3 新型疫苗

利用基因重组技术，狂犬病毒中起主要免疫作用的糖蛋白及核蛋白已在不同的载体系统中得到表达。这些载体包括痘病毒、腺病毒、杆状病毒、质粒DNA等。有望最终发展成为安全有效的人用基因工程疫苗。

4 参考文献

[1] COX JH，B DIETZSCHOLD，L G SCHNEIDER.Rabies virus glyc-oprotein II.Biological and serological characterization[J].Infect Immun，1997（16）：751.

[2] LAO TR，MINAMOTO N，ITO H，et al.A virus～neutralizing epitope on the glycopmtein of rabies virus that contains Trp251 is a linear epitope[J].Virus Res，1997，51（1）：35.