论新型疫苗的研究概况与进展

李文艺

摘要 随着免疫学和分子生物学技术的快速发展，近年来出现了各种不同的新型疫苗，这类疫苗的出现弥补了传统疫苗的缺点，也填补了疫苗种类的空白。就重组活载体疫苗、树突状细胞疫苗、T细胞疫苗、食物疫苗、DNA疫苗、RNA复制子疫苗、多肽疫苗和抗独特型抗体疫苗等8种新型疫苗的研究概况与进展进行论述。

关键词 新型疫苗；研究概况；研究进展

中图分类号 Q342+.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）05-0220-03

疫苗是一种用于预防和治疗传染病或某些慢性疾病的生物制品，实际生产中应用最广泛的是传统灭活疫苗和减毒活疫苗，但两者在生产实际中均存在着免疫效果不确实、非特异性反应强、保护期短等缺点，这就使得新型疫苗的出现成为必然，各种新型疫苗的研制越来越多地受到关注。新型疫苗是应用基因工程技术和生物化学合成技术生产的疫苗。笔者就目前出现的几类新型疫苗作一论述。

1 重组活载体疫苗

活载体疫苗是将编码病原微生物特异性抗原的基因片段插入减毒的活细菌或病毒载体基因组的某些部位，使之高效表达，从而诱生强有力的抗体和细胞介导的免疫应答，使机体获得对插入基因相关疾病的抵抗力。

1.1 重组细菌疫苗

可作为基因工程疫苗载体的细菌很多，但从疫苗的安全性和能诱导特异性免疫反应的角度出发，减毒沙门菌和卡介苗是最佳载体。在2003年SARS爆发后，研究者们首先考虑用灭活的SARS-Cov来抵御SARS。一般用福尔马林、紫外线或β-丙内酯灭活SARS-Cov。用紫外线灭活的SARS-Cov免疫小鼠可产生体液免疫应答和细胞免疫应答，加强免疫后可观察到细胞增殖和细胞因子表达上调[1] 。He等[2]报道β-丙内酯灭活的SARS-Cov免疫小鼠和兔子都可产生高滴度的抗体，这些抗体能够识别S蛋白特别是RBD，并阻止RBD与ACE2的结合。纯化的灭活SARS疫苗免疫猴子可产生高水平的中和抗体，并能阻止SARS-Cov在猴子体内的复制，该疫苗对猴子是安全且有效的[3]。SARS灭活疫苗的Ⅰ期临床试验在我国已完成，II期临床试验方案已拟订，该疫苗的安全性和有效性有待于进一步评估。由于灭活疫苗不能诱导细胞免疫、免疫原性低、产生免疫力慢及在制备过程中存在较大危险等缺点，故在T细胞表位和B细胞表位被鉴定后，SARS灭活疫苗可能将被取代。

1.2 重组病毒疫苗

以病毒为载体的基因工程疫苗可视为病毒减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合，既可避免亚单位疫苗需要佐剂及多次接种注射的缺点，又可诱导全面而持久的免疫反应，可作为减毒活疫苗的病毒载体有痘苗病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒及单纯疱疹病毒等，其中最常用的是痘苗病毒和腺病毒。

痘苗病毒是基因工程中的常用载体，是人类使用了近200年的最为安全的疫苗[4]，而且牛痘苗病毒能感染许多不同类型的细胞，能容纳大分子外源基因，能在感染的早期或晚期高水平地表达外源基因，且病毒的耐热性强，易获得高效价的抗体，是十分理想的载体；能表达牛瘟病毒血凝素或融合糖蛋白抗原的牛痘病毒基因工程疫苗，能产生高效价的中和抗体，并可使牛获得攻毒保护[5-7]是一个成功的例子。禽痘弱毒疫苗株已广泛用于生产禽病重组疫苗。利用禽流感病毒的保护性抗原HA和NA、HA糖蛋白和NA蛋白能够产生有保护作用的抗体，NP有种特异性，能产生有保护作用的抗体和细胞免疫反应。台湾谢快乐等用台湾AIV分离株（H8N4）的外膜蛋白HA和NA制作了免疫复合物亚单位疫苗，同时制作了灭活的油佐剂疫苗，用血凝抑制试验作为评价2种疫苗免疫效果的标准，结果表现差异不明显，只是在加强免疫时亚单位疫苗抗体升高比油佐剂苗明显。Kodihalli S等[8]研制了火鸡H5N2病毒HA和核蛋白（NP）复合亚单位疫苗，发现该疫苗可以对同源和异源亚型病毒的攻击产生保护作用。常规制备亚单位疫苗的过程复杂、成本高，而重组DNA和分了克隆技术的发展恰恰为克服以上缺点提供了可能。John Crawford等[9]利用杆状病毒表达系统表达了H5、H7亚型AIV的HA佐剂疫苗，用这2种疫苗分别免疫3周龄Rock鸡，对高致病性强毒的攻击均能产生100%的保护。

基因重组活载体原理制备禽流感疫苗的技术已趋于成熟。2002年，程坚等[10]把H9亚型禽流感病毒HA基因、鸡II型干扰素（IFN-II）基因分别置于痘苗病毒P7.5启动了和鸡痘病毒早晚期启动了PE/ L下游，构建了共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡IFN-II的重组鸡痘病毒。动物试验表明，该重组病毒能显著抑制静脉攻毒后的1日龄SPF鸡及含母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒，并能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒抑制1日龄SPA雏鸡增重的副作用。我国哈尔滨的Qiao C. L.等[11]在2003年构建了能同时表达H5N1亚型HA基因和NA的重组禽痘病毒重组疫苗，攻毒结果显示该疫苗具有良好的免疫保护性。

2 树突状细胞疫苗

树突状细胞（dendritic cell，DC）是动物体内功能最强大的抗原递呈细胞，具有摄取、加工抗原，以组织相容性复合体（MHC I和MHC II ）肽结合物的形式递呈抗原，并促进T、B淋巴细胞增殖的能力。研究发现DC能强有力地激活幼稚型T细胞，少量的抗原和树突状细胞即足以激活T细胞[12-15]，并且可诱导很强的初次免疫应答，前期的体外试验和动物试验表明，以适当形式的肿瘤抗原，不论是蛋白质、多肽还是核酸加载的DC疫苗，都能够激活杀伤肿瘤细胞的抗原特异性T细胞，并可产生免疫记忆效应。荷载抗原的DC具有疫苗的功能，因此称为树突状细胞疫苗。

DC疫苗主要有三大类，即细胞性肿瘤抗原修饰的DC，肿瘤抗原肽修饰的DC和肿瘤抗原基因转染的DC[16]。

3 T细胞疫苗

T细胞疫苗指将能引起迟发型变态反应的T细胞作为疫苗接种，用于治疗某些自身免疫性疾病。后来发现依据MHC I类分子特异的多肽结合基序（MHC binding motif）合成的多肽，在体外诱导产生的抗原特异性细胞毒T细胞可用于治疗病毒性疾病，这种体外活化的T细胞也称为T细胞疫苗[12]。

由T细胞引起的迟发型变态反应可能是某些自身免疫性疾病的病因，因此将可致病的T细胞灭活后作为疫苗注入体内，用于治疗某些自身免疫性疾病[13]。小鼠变态反应性脑脊髓炎的试验已获成功，在人类多发性硬化症中也有一定效果。

病毒特异性的T细胞（cytoxic T lymphocyte，CTL）介导的细胞免疫具有清除病毒的功能，是宿主防御病毒感染的主要机制之一。传统病毒疫苗（减毒苗和灭活苗），含有完整的病毒蛋白以刺激机体产生抗体为主，难以有效诱导产生MHC I类分子限制性的CTL和清除感染细胞内的病毒颗粒。T细胞疫苗是用多肽在体外诱导产生特异性CTL，经过克隆、扩增、筛选和鉴定后，将MHC I类分子限制的CD8+T细胞输人机体，诱导产生细胞免疫应答[14]。

4 食物疫苗

食物疫苗包括植物性食物疫苗和动物性食物疫苗两大类[17]。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，通过基因工程改造的转基因动植物已成为一种新型的生物反应器，作为疫苗生产系统。

植物性食物疫苗的概念是由Mason等（1992）提出转基因植物时产生的，研究表明，细菌性和病毒性病原体抗原可以在植物中表达，且表达后的抗原仍能保留天然抗原的免疫原性[13]。利用植物病毒为载体，经遗传改建，使其携带外源抗原基因片段，此重组植物病毒感染植物组织后，通过在宿主植物中的增殖，得到外源抗原基因编码产物。也可将编码保护性抗原蛋白的结构基因克隆人Ti质粒，用重组质粒转化作物杆菌，然后再用携带重组质粒的作物杆菌感染植物细胞把导入的外源基因整合到这些植物细胞的染色体基因组中，含外源基因染色体的植物细胞在一定条件下可以生长成新生的植株，该植株可以在生长过程中表达外源基因，并将此性状传给子代，成为表达疫苗的品系[18]。

烟草是转基因植物研究的模式表达系统，已有多种外源基因在转基因烟草中成功表达，如乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis A virus surface anti-gen，HBsAg）、霍乱毒素B亚单位、nor-walk病毒膜蛋白等。特别是转基因植物口服疫苗的优势非常明显，水果、黄瓜、胡萝卜和番茄等植物是可以生食的，合适的抗原基因只要在该植物可食用部位的器官特异表达启动子驱动下，经转化得到的转基因植物即可直接用于口服免疫。在植物中高效表达产生的抗原作为食物时，可刺激体液和黏膜免疫应答并能安全通过动物消化道而不被蛋白酶降解，成为黏膜性抗原。Amtzen等将大肠埃希菌内毒素基因导入马铃薯中，得到的转基因马铃薯块茎被小鼠食用后在小鼠体内检测出内毒素的抗体。迄今为止，国外已经有几十种药用蛋白或多肪在植物中得到表达，有的已投入商品化生产。

开发动物性食物疫苗是一个迅速发展起来的新领域。将编码保护性抗原的目的基因片段通过载体导入动物细胞使其表达并分布于肉、蛋或乳中，以转基因动物作为生物反应器。另外，国内外一些研究人员把某种抗原通过肌肉注射或口服进入奶牛/羊体内刺激其免疫系统，提高其乳汁的特异性抗体含量，采用低温喷雾干燥技术生产出免疫奶粉，可保持其中特异性抗体的活性。

可见，无论是植物性食物疫苗还是动物性食物疫苗，在未来的疫苗领域都有着很大的发展空间，而且它们具备传统疫苗所不具备的优势，故受到越来越多的关注。

5 DNA疫苗

DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，是将编码某种目的抗原蛋白的基因克隆到哺乳动物真核表达载体置于真核表达元件的控制之下，并将其直接导入动物机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。

DNA疫苗有很多传统疫苗所不具有的优点，例如，没有感染的危险，可诱发针对天然蛋白表位的抗体和特异性的细胞毒性T细胞免疫反应，可维持长期持续的免疫反应，便于构建多价疫苗，稳定性不受温度影响，可快速筛选具有免疫保护效果的基因以及具备预防和免疫治疗的双重功能等。最常见的DNA疫苗接种方案是间隔2~3周连续多次注射，但如果将DNA疫苗与蛋白质疫苗交替注射有可能获得更好的效果。由于DNA疫苗是一种新型疫苗，目前大多数DNA疫苗处于第I期临床试验阶段，其主要目的是证明疫苗的安全性和免疫原性。数年的临床观察尚未发现疫苗的DNA分子会整合到染色体中去或诱发自身免疫病的可能性。令人鼓舞的是疟疾DNA疫苗的临床试验已进入第Ⅲ期，预计不久将正式作为商品上市[19]。目前，正在研发中的SARS-Cov DNA疫苗主要有以下几种。

5.1 基于S蛋白的DNA疫苗

基于S蛋白的DNA疫苗既能诱导中和抗体，也能诱导特异的CTI，因此被认为是有前景的疫苗之一。Yang等[20]报道用编码SARS-Cov S蛋白的DNA疫苗免疫小鼠，不仅能诱导T细胞免疫应答，也能诱导中和抗体的产生，并使肺部病毒的浓度降低6倍。此外，已有文献报道抗S蛋白的抗体可中和同源的SARS-Cov毒株，但这些抗体可促进人的早期SARS-Cov分离株GD 03T0013和猫科SARS-Cov样病毒的感染[21]。S蛋白含有几个可诱导高滴度非中和性抗体的线性免疫优势结构域，非中和性抗体能否促进SAR S-Cov 感染或介导有害的免疫应答还不清楚。这些研究结果表明，应对表达全长S蛋白的DNA疫苗的安全性和有效性给予关注。RBD不仅是一个功能结构域，而且含有S蛋白主要的中和表位。编码RBD的DNA疫苗诱导产生的中和抗体的浓度比表达全长S蛋白的DNA疫苗诱导的中和抗体浓度高。RBD与恢复期SARS病人的抗血清有较强烈的反应，从抗血清中纯化的抗体能抑制RBD与ACE2结合[2，22，23]。与全长S蛋白不同，RBD不含诱导非中和性抗体的免疫位点，这表明RBD是一个理想的SARS疫苗候选者。

5.2 基于N蛋白的DNA疫苗

N蛋白是SARS-Cov的内部蛋白，比其他蛋白如S、M等保守，这使它成为一个理想的疫苗候选者。成功的SARS疫苗应能诱导产生强的、广谱的、持久的中和抗体和保护性的T细胞免疫应答。N蛋白不仅能诱导体液免疫应答，而且也能诱导广泛的细胞免疫应答。表达N蛋白的重组质粒载体免疫小鼠3次后，可观察到CTL和抗体应答。钙视网膜蛋白（Calreticulin，CRT ）与N蛋白融合的DNA疫苗免疫C57BL /6鼠，可产生N蛋白特异的体液免疫应答和细胞免疫应答[24]。Peng等[25]报道，所有SARS患者都存在SARS-Cov N蛋白特异性记忆CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且在抗原缺失的情况下可持续存在2年。M蛋白的表达可以促进SARS-Cov N DNA疫苗免疫的Bulb/c鼠产生N蛋白特异性抗体，而且 M蛋白和N蛋白的共同免疫可降低SARS-Cov引起的死亡和肺部的病理变化[26]。M蛋白能够增强N蛋白特异性抗体产生和T淋巴细胞活性的机制还不清楚。

5.3 表位疫苗

表位疫苗即用抗原表位制备的疫苗，含有合理设计的保护性表位，如B表位、T表位，可刺激效应B细胞和T细胞免疫应答。多表位抗原既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫，所以多表位疫苗被认为是防治SARS最好的方式。S、E、M和N蛋白的表位已相继被鉴定，不过已鉴定的表位多为B表位和中和表位，T表位较少。SARS-Cov的CTL表位可被90%的人白细胞抗原递呈，这已被生物信息学所鉴定[27]。因此，研究SARS-Cov B细胞表位和T细胞表位的特点、T细胞应答的MHC限制性及抗原递呈的特异性对研发表位疫苗很重要。

尽管基因疫苗的发现为研究新型疫苗提供了一个新思路，是很多蛋白质疫苗所不能比拟的，但毕竟处于试验阶段，仍存在危险性，如产生抗DNA抗体的可能性，外源DNA与宿主基因组DNA整合的可能性，免疫耐受性和自身免疫产生的可能性等[28]。

6 RNA复制子疫苗

RNA复制子疫苗是一种基于RNA病毒的复制子，能够进行自我复制的新型疫苗，保留了病毒的复制酶基因，结构基因由外源基因所代替，复制酶可控制载体RNA在胞质中高水平复制和外源基因高水平的表达。RNA复制子疫苗被包装成病毒样颗粒后，大大提高了稳定性[29]。被感染的细胞能分泌释放抗原（或者是细胞凋亡后释放抗原），刺激B细胞生成抗体。同时，抗原被抗原递呈细胞摄取，在内体被降解成为肽段，与MHC II类分子结合，经高尔基体运至细胞表面，被含有TCR/CD3复合物的CD4+T细胞识别，发挥体液免疫作用。

7 多肽疫苗

按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，用人工方法合成抗原肽，或通过化学分解和有控制的蛋白水解，使天然蛋白降解为小片段，筛选出具有免疫活性的片段或有中和特性的单克隆抗体识别相关抗原表位，这种保护作用类似天然抗原决定簇的多肽，配以适当载体与佐剂制成的疫苗称多肽疫苗，如HBsAg的各种合成物、人工合成的白喉毒素14个氨基酸肽、流感病毒血凝素的18个氨基酸肽等。试验表明，多肽疫苗可以产生相应的中和抗体，并对相应病原微生物攻击具有一定的保护力[30]。

8 抗独特型抗体疫苗

免疫系统内所有的抗体分子或淋巴细胞的抗原受体上都存在着独特型（idiotype，Id）抗原决定簇，它能被体内另一些淋巴细胞所识别并产生抗独特型抗体（antiidiotype，AId或Ab2）[31]。目前，抗独特型疫苗研究仍处于动物试验研究阶段，疫苗的范围主要有病毒、细菌和原虫等引起的疫病、恶性肿瘤及某些自身免疫性疾病。

新型疫苗的发展给人类以及动物疾病的预防和治疗带来新的希望，尽管新型疫苗有各种缺陷，但随着分子生物学、免疫学等学科的发展，新型疫苗经过不断改造，将会更理想的服务于人类。

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