Ａｎｇ－１对高糖中培养的ＲＦ／６Ａ的影响

左中夫　王轶晶　冯　闯　刘学政

【摘要】 目的 探讨血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）对高浓度葡萄糖中培养的猴脉络膜-视网膜内皮细胞（RF/6A）的保护作用。方法 RF/6A分3组培养：对照组（DMEM培养基含25 mmol/L葡萄糖）、高糖组（DMEM培养基含40 mmol/L葡萄糖）、Ang-高糖组（DMEM培养基含40 mmol/L葡萄糖+0.25 mg/L Ang-1）。利用台盼兰染色法及MTT比色法检测体外培养的各种RF/6A存活率及细胞活力，利用western-blotting法检测各组suivivin表达。结果 1 d时各组细胞存活率及活力无差异。3、5、7 d时高糖组和Ang-高糖组细胞存活率及细胞活力均较正常组下降（P<0.05），高糖组细胞存活率及细胞活力低于Ang-高糖组（P<0.05）。5 d时，Ang-高糖组survivin表达明显较其他两组增多（P<0.05）。 结论 高糖能降低RF/6A的存活率和活力，而Ang-1能明显增强高糖环境中RF/6A的存活率和活力,其机制可能与Ang-1上调凋亡抑制基因survivin的表达有关。

【关键词】 血管生成素-1；高糖； survivin表达

Effects of angiopoietin-1 on RF/6A in high glucose environment

ZUO Zhong-fu,WANG Yi-jing,FENG Chuang,et al.Department of Pathophysiology,Liaoning Medical University,Jinzhou City,Liaoning 121001,China

【Abstract】 Objective To explore the damage of high glucose on rhesus macaque choroids-retinal endothelial cell（RF/6A）and also evaluate the protective effect and mechanisms of Angiopoietin-1(Ang-1) on RF/6A in this environment.Methods RF/6A were divided into 3 groups to be cultured:(1) control group (DMEM containing 25 mmol/L glucose); (2) high glucose group (DMEM containing 40 mmol/L glucose); (3) Ang-high glucose group (DMEM containing both 40 mmol/L glucose and 0.25 mg/L Ang-1).Each group were evaluated by measurement of MTT,trypan blue dye exclusion method at the 1 st,3rd,5th and 7th day respectively,and evaluated by western-blotting at the 5th day to determine the expression of survivin.Results At the 3rd,5th and 7th day,lower cell proliferation and livability in high glucose group and Ang-high glucose group were showed,compared with control group (P<0.05),the same tendency was observed in high glucose group compared with Ang-high glucose group (P<0.05).The western-blotting showed the expression of survivn in Ang-high glucose group was significantly higher than other two groups (P<0.05).Conclusion High glucose can decrease the proliferation and livability of RF/6A while Ang-1 limits these damages in high glucose environment may by way of up regulating the expression of survivin.

【Key words】 Angiopoietin-1; High glucose; Expression of surviving

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最为常见和最为严重的并发症之一，可导致患者视力下降甚至完全失明。该病发病机制尚不完全清楚，但内皮细胞(endothelial cell，EC)和周细胞(pericyte)的凋亡加速在DR的发展中起到了重要作用。血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）参与调节血管成熟，维持EC稳定，是决定血管退行萎缩或者渗漏增殖的重要因素［1-4］。虽然目前对Ang-1的生理作用研究较多，但是对于Ang-1在高糖环境中对EC的影响的研究鲜有报道。本研究以RF/6A这种EC对此进行了初步的探讨，以期为Ang-1应用于临床治疗DR提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 猴脉络膜-视网膜内皮细胞（中科院上海细胞库），DMEM高糖培养基（Gibco公司），survivin抗体（Santa Cruz公司），台盼蓝（sigma公司），MTT（sigma公司），酶标仪（北京普郎克公司）超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所,92-Ⅱ型),Kodak电泳图象分析系统(Kodak公司，EDAS290型)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将RF/6A以DMEM高糖完全培养基（含丙酮酸钠，2 mmol/L L-谷胺酰胺，15%胎牛血清，100 U/ml青霉素,0.1 mg/ml 链霉素），于37℃，5%CO₂，饱和湿度孵箱中培养，当细胞铺满细胞瓶底的90%后，以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，按照1∶2~1∶4进行传代分组培养：对照组（DMEM培养基含25 mmol/L葡萄糖）、高糖组（DMEM培养基含30 mmol/L葡萄糖）、Ang-高糖组（DMEM培养基含30 mmol/L葡萄糖+0.25 mg/L Ang-1）。

1.2.2 台盼兰检测细胞存活率 调整细胞浓度,以1×10⁴/孔的密度接种于96孔板，每孔200 μl。检测前4 h换成相应的无血清培养基，每孔再加入MTT（5 mg/ml）20 μl，37℃孵育4 h后弃去孔内培养液,加入150 μl二甲基亚砜，振荡15 min使结晶物充分溶解。以空白孔调零，570 nm波长检测，630 nm波长校正，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（A值），按公式计算实验组的细胞存活比例：细胞存活率=检测组A值/对照组A值×100%。

1.2.3 MTT比色法检测细胞活力 以1×10⁴/孔的密度，将RF/6A接种于96孔板，每孔200 μl。培养至1、3、5、7 d时用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化细胞，制成细胞悬液，与浓度为0.4%的台盼蓝溶液按照1:1比例混匀，室温下作用3 min后，于15 min内于血球记数板上计数呈蓝色细胞。根据下式计算细胞活力：（总细胞数-着色细胞数）/总细胞数×100%。

1.2.4 western-blotting检测survivin表达 实验组细胞培养5 d，去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍，加入裂解液后置于冰上15 min，以细胞刮收集细胞于EP管，超声（200 W）3 s×2次裂解细胞。以12 000 g，4℃离心2 min。取少量上清液进行定量，以牛血清蛋白(BSA)为标准品，采用考马斯亮蓝法，于酶标仪490 nm下测定光密度值(OD值)，计算提取总蛋白的浓度，将所有蛋白样品调至等浓度上样（上样前100℃水浴3 min），以80 V电压常规SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维膜，用封闭液(1×TBST，5%脱脂奶粉) 4℃封闭过夜，再用抗体稀释液(1×TBST，1%脱脂奶粉)1∶250稀释一抗。与经封闭液处理的PVDF膜置于小封口塑料袋内37℃孵育2 h。1×TBST液洗膜3次，每次20 min。然后，以同样方法，1∶4500稀释二抗、37℃孵育1 h，1×TBST液洗膜3次，每次30 min。将膜置于含BCIP（33 μl）/NBT（66 μl）的染色液10 ml，于室温下轻轻摇晃，使蛋白条带逐渐显影、定影，胶片洗涤干燥，利用Kodak电泳图象分析系统对图片各电泳条带亮度进行扫描，对各组电泳条带的显影相对强度进行统计分析。

1.3 统计学方法 数据均采用（x±s）表示，利用SPSS 13.0统计软件进行方差分析及LSD-t检验，P<0.05认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色法检测细胞存活率 1 d时各组之间无差异。3、5、7 d时尽管高糖组和Ang-高糖组的细胞存活率都低于对照组（P<0.05），但高糖组的细胞存活率最低，低于Ang-高糖组的高于（P<0.01），见表1。

2.3 western-blotting检测survivin表达 分组培养第5天后，western-blotting检测survivin表达，并分析其相对显影强度的结果显示，Ang-高糖组survivin表达量明显高于其他各组（P<0.05），见图1，表3。

3 讨论

高糖诱导EC功能障碍的机制尚不十分明确，主要与以下因素有关［5］：多元醇途径的激活，细胞内蛋白质的非酶糖基化，细胞内信号的调制，一氧化氮产物的改变，自由基增多，DNA功能紊乱，糖酵解增强，产生乙酰Co-A过多。这些机制可能独立或共同参与高糖致EC凋亡的过程。本实验对细胞活力和细胞存活率检测表明，高糖组和Ang-高糖组的细胞活力和细胞存活率都低于对照组，可能与高糖诱导的细胞凋亡和功能障碍有关。

Ang-1是继血管内皮细胞生长因子后发现的又一重要的血管生成因子，与其受体结合后可通过跨膜的信号传导路径激活PI3K/Akt，抑制线粒体酶释放，上调凋亡抑制基因survivin的表达［6］。survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，其抑制细胞凋亡的作用远大于Bcl-2家族成员［7］，survivin表达增高可以拮抗正常生理环境中的EC调亡，促进EC生长［8］。本实验中Ang-高糖组survivin表达明显高于其他各组，这表明Ang-1也能上调高糖环境中EC survivin的表达。实验中发现，Ang-高糖组的细胞活力和细胞存活率都高于高糖组，可能是由于Ang-1上调了凋亡抑制基因survivin的表达，减少了RF/6A的凋亡所致。

参 考 文 献

［1］ Suri C,Jones PF,Patan S,et al.Requisite role of angiopoietin-1,a ligand for the TIE2 receptor,during embryonic angiogenesis.Cell,1996,87(7):1171-1180.

［2］ Sato TN,Tozawa Y,Deutsch U,et al.Distinct roles of the receptor tyrosine kinases Tie-1 and Tie-2 in blood vessel formation.Nature,1995,376(6535):70-74.

［3］ Thurston G,Rudge JS,Loffe E,et al.Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against plasma leakage.Nat Med,2000,6(4):460-463.

［4］ Thurston G,Suri C,Smith K,et al.Leakage-resistant blood vessels in mice transgenically overexpressing angiopoietin-1.Science,1999,286 (5449):2511-2514.

［5］ 王大江,方伯言,伍刚,等.高糖对牛视网膜微血管内皮细胞损伤的实验研究.锦州医学院学报,2004,25(3):1-4.

［6］ Procopio WN,Paul IP,Lee WMF,et al.Angiopoietin-1 and-2 Coiled Coil domains mediate distinct homo-oligomerization patterns,but fibrinogen-like domains mediate ligand caativity.J.Bial Chem,1999,274(42):30196-30201.

［7］ Ambrosini G,Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin expressed in cancer andlymphoma.Nat Med,1997,3(8):917-921.

［8］ Hadouche R,Hassessian HM,Guo Y,et al.Mechanisms which mediate the antiapoptotic effects of angiopoietin-1 on endothelial cells.Microvasc Res,2002,64(1):135-147.