倍他司汀、西咪替丁对原发性肝癌大鼠肝微粒体CYP450的影响

陈艳平 张毅民 王乃平 韦锦斌

[摘要] 目的 研究倍他司汀和西咪替丁对原发性肝癌大鼠肝微粒体CYP450的影响。方法 以二甲基氨基偶氮苯诱发大鼠原发性肝癌,观察倍他司汀和西咪替丁对大鼠第一相酶细胞色素P450的影响。结果整个实验过程中,倍他司汀组和西咪替丁组大鼠细胞色素P450含量处于低水平并呈下降趋势,与模型组比较,差异显著(P<0.01)。结论 倍他司汀和西咪替丁可以抑制原发性肝癌大鼠肝微粒体细胞色素P450活性,从而抑制二甲基氨基偶氮苯在肝脏中的活化而降低他的致癌性及化学肝损伤。

[关键词] 原发性肝癌;倍他司汀;西咪替丁;CYP450

[中图分类号] R965[文献标识码] A[文章编号] 1004-8650(2009)06-023-03

The Effects of Betastine and Cimetidine on CYP450 of the Primary Liver Cancer of Wistar Rats

CHEN Yan-ping1, ZHANG Yi-min2, WANG Nai-ping3, WEI Jin-bin3

(1.Changsha Central Hospital Medical Section,HunanChangsha410005China;2.Fujian Provincial Corps Hospital, Chinese People's Armed Police Forces,Fuzhou350003China;3.Guangxi Medical University,GuangxiNanning530021,China)

[Abstract] ObjectiveTo study the effects of betastine and cimetidine on CYP450 of the primary liver cancer of Wister rats。MethodsDimethylamino-axobenzene was used to induce the rat liver cancer model in order to observe the influences of BET and CIM on the content of CYP450。Results During the experiment,the contents of CYP450 in betastine group and cimetidine group were maintained a low level and showed a tendency of decreasing;Compared to the model group,there was significant difference (P<0.01) between them。Conclusion Betastine and cimetidine can decrease the content of CYP450 of the primary liver cancer of Wister rats and also restrained dramatically activity of dimethylamino-axobenzene in the liver of rat and reduced the hepatocarcinoma rate.

[Key words] primary liver cancer;Betastine;Cimetidine;CYP450

CYP450是体内参与生物活性物质、激素和外来异物包括药物代谢灭活的重要酶系,酶活性的高低直接影响到物质代谢的速度。

倍他司汀(betahistine, BET,抗眩啶)是组胺H1受体激动剂,能增加内耳、肝脏等组织血流量,临床主要用于内耳眩晕症[1]。经查新,国内外未见BET用于肝癌预防、治疗的报道。王乃平等发现BET有预防、治疗大鼠原发性肝癌的趋势[2],同时,本课题组前期实验发现BET为细胞色素P450抑制剂。

西咪替丁(cimetidine,CIM)是一种H2受体拮抗剂,同时也是一种经典的细胞色素P450的抑制剂,临床上用于消化性溃疡,近年发现他有抗肿瘤作用,可以抑制许多实验性肿瘤的生长和转移并可以延长动物的存活期,临床上被用于抗肿瘤(如大肠癌)[3]。本实验用二甲基氨基偶氮苯(DAB)诱导大鼠原发性肝癌模型,以期研究BET和CIM对原发性肝癌大鼠肝微粒体CYP450的影响。

1材料和方法

1.1动物

Wistar大鼠,雄性,体重(130±20)g,由广西医科大学实验动物中心提供。

1.2试剂及药物

BET[日本卫材株式会社,卫材(苏州)制药有限公司分装,批号:020803]; CIM(原料药,西南制药一厂,批号:030220);DAB(上海远航化工厂,批号:011112);蛋白定量(双缩脲法)测试盒( 南京建成生物工程研究所,批号:030512)。

1.3主要仪器设备

高速分散匀质机(FJ-200型,上海标本模型厂);高速低温离心机(EppendorfCentrifuge 5804R型,德国);紫外-可见光分光光度计(DU-640G型,美国Beckman公司);双光束紫外分光光度计(LAMB DAB1020,美国)。

1.4大鼠原发性肝癌模型的建立及给药

1.4.1 诱癌药粮及药物的配制:用DAB制成6%的花生油溶液,每100ml DAB油溶液与5kg大米拌匀,配成即每克大米含1.2mg DAB的诱癌药粮;将BET按大鼠7.2mg/kg给药量用水配成混悬液;将CIM按大鼠100mg/kg给药量用水配成混悬液。

1.4.2 分组、给药及模型建立:将雄性Wistar 大鼠随机分成对照组(30只)、模型组(68只)、BET(45只)组和CIM(45只)组。对照组,用普通大米饲养,饮自来水;模型组,用诱癌药粮饲养,饮自来水;BET组和CIM组分别饮用各药物混悬液,用药同时,先给普通大米饲养2周,后给诱癌药粮饲养。模型组和各给药组均用诱癌药粮饲养,以诱发肝癌形成,时间为32周。

1.5大鼠肝脏标本、肝微粒体及血清的制备

在给诱癌药粮后第8周、第16周,每组大鼠各取5只,32周后取全部大鼠,称其体重,拔眼球取血,脱颈椎处死,迅速剖腹取肝脏,称肝重。剪部分组织用10%甲醛溶液固定,做病理切片检查。取部分肝脏迅速置于液氮中存放后置-80℃超低温冰箱冻存备用。余下肝脏用注射器吸取预冷1.15% KCl冲洗至灰白色,吸干。取肝重0.5左右,加2倍肝重的15%甘油-20mMPBS溶液,用高速分散匀浆机匀浆。将匀浆液于高速成冷冻离心机离心10min(3000rpm),取富含肝微粒体(MS)的上清液,继续冷冻离心1h(10000rpm),用15%甘油-20mMPBS溶液1ml稀释沉淀物,即得肝微粒体(MS),于-80℃冰箱保存备测。血液凝固后,以3,000rpm,4℃离心15min,取上清即血清,-20℃保存备测。

1.6CYP450含量测定

取各组不同时期大鼠MS标本各5份进行测定,其中蛋白质含量测定依蛋白定量测定(双缩脲法)试剂盒说明书测定肝微粒体MS蛋白含量;参见文献[4],Beckman比色杯中加入15%甘油-20mMPBS溶液2ml+MS100μl+数mg保险粉,于Beckman DU-640紫外可见分光光度计调零,用小儿头皮针输液管通入CO 30s,样品扫描测定,记录420nm、450nm、490nm处的OD值,根据公式计算各样品P450含量。

1.7统计方法

酶学数据用均数±标准差表示,以SPSS V11.0 for Windows统计软件进行t检验或?字2检验。

2结果

2.1成癌率

本课题组前期实验表明,用DAB药粮诱癌24周后为肝癌形成期,本实验中所有死亡动物(无法得到完整尸体者除外)经解剖或根据病理检查,最早1例肝癌出现于25周(模型组),现以25周动物数,25-32周成癌数计算成癌率。结果显示,CIM组和BET组的成癌率显著低于模型组(Tab. 1)。

2.2CYP450的含量变化

给予大鼠诱癌药粮8周后,模型组CYP450含量有所增加,与对照组比较有差异(P<0.05);BET组和CIM组CYP450含量处于较低水平,与对照组比较有差异(P<0.05),与模型组比较差异显著(P<0.01)。16周后,模型组CYP450升高较快达到峰值,与对照组比较差异明显(P<0.05);BET组和CIM组仍然处于较低水平,与对照组比较差异显著(Ρ<0.01),而与模型组比较差异显著(Ρ<0.01)。32周后,模型组CYP450明显下降,达到最低值,与对照组比较差异显著(Ρ<0.01);BET组一直处于低水平,与对照组和模型组比较均有差异(Ρ<0.05);CIM组也一直处于低水平,与对照组比较差异明显(Ρ<0.01),而与模型组比较差异显著(Ρ<0.01);BET组与CIM组比较三个时期差异均无统计学意义(Tab. 2,Fig.1)。

3讨论

本实验以含DAB的诱癌药粮进行原发性肝癌模型复制,从病理切片可见,模型组大鼠肝癌为高分化的肝细胞肝癌。肝癌发生率为69.57%,说明肝癌模型复制成功。而BET组和CIM组大鼠在实验早期肝脏的损伤程度明显较模型组轻,成癌率明显比模型组低,说明BET和CIM可以减轻或延缓大鼠肝损伤,降低成癌率。

DAB为偶氮类化合物,与广泛存在于环境中的致癌物质结构类似,是动物实验性肝癌中的一种致癌率较高的致癌剂。在体内DAB经肝脏CYP450的N-去甲基化,N-氧化作用及酯化作用,转化为活性致癌物。DAB对肝脏的损伤,一方面表现为非特异性毒性作用,DAB作用于肝细胞,损伤肝细胞一些重要酶系,如定位于细胞线粒体嵴和内膜上的琥珀脱氢酶(SDH),定位于肝细胞膜的5,-核苷酸酶(5,-NH)等,使肝细胞发生变性、坏死,继而坏死周边肝细胞明显再生,胆管上皮增生及大量纤维结缔组织增生而形成假小叶及再生结节,将肝组织转变成肉眼可见的颗粒型肝硬变,进而肝细胞或胆管上皮过度增生、异型增生以至癌变。个别病例也可能并未形成肝硬化而直接形成肝癌。另一方面,由于DAB可能破坏肝细胞内质网、线粒体、核糖体等细胞器,从而影响蛋白质合成。组胺受体蛋白的减少,降低了机体对肿瘤细胞的自然免疫反应,还可能会对组胺的代谢及效应产生影响,导致肝细胞及磷脂代谢的紊乱而加重肝细胞的损害,造成恶性循环,促进肝癌癌变的发展[5]。

CYP450同工酶可分为“解毒”和“增毒”两大类[6],CYP1A和CYP2E在多种前致癌物或前毒物的代谢活化中起重要的催化作用,属于"增毒"类CYP450,存在对癌症的多态易感性[7]。从CYP450的含量变化曲线可见,模型组大鼠中的CYP450含量先升后降,而BET组与CIM组大鼠一直处于较低水平,并有下降趋势。本实验组前期实验发现BET与CIM同属肝药酶抑制剂,结合本实验表明他们可能可以抑制这类"增毒"CYP450活性,从而抑制DAB在肝脏中的活化而降低他的致癌性及化学肝损伤。当然,BET和CIM减轻或延缓大鼠肝损伤、降低成癌率的这种作用或许还与其分别作为组胺的H1受体激动剂和H2受体拮抗剂有关。组胺通过不同受体产生双重但相互拮抗的免疫调节作用,这与肿瘤的发生有密切联系,即组胺受体介导的肿瘤双向效应[8]:H1受体兴奋可增强免疫反应,H2受体兴奋可抑制免疫反应。现已证明,组胺可抑制促分泌素诱导的淋巴细胞增生反应[9]。动物及人体中的抑制性T细胞上有组胺H2受体[10],而效应T细胞或反抑制性T细胞膜上有组胺H1受体[11]。组胺的免疫抑制效应主要由H2受体介导,H2受体拮抗剂可以阻断组胺对淋巴因子和淋巴细胞增殖的抑制,增加对肿瘤细胞的自然免疫反应,抑制肿瘤细胞的生长[12],说明组胺通过淋巴细胞上H1受体兴奋可增强免疫反应,H2受体兴奋可抑制免疫反应。因此BET作为H1受体激动剂,CIM作为H2受体拮抗剂都能增强大鼠的免疫反应,从而减轻或延缓致致癌剂DAB对大鼠肝损伤、降低成癌率。

BET和CIM能减轻或延缓致癌剂DAB对大鼠肝损伤、降低成癌率这种作用的作用机制究竟是因为其抑制这类“增毒”CYP450活性,从而抑制DAB在肝脏中的活化而降低他的致癌性及化学肝损伤,还是因为与其分别作为组胺的H1受体激动剂和H2受体拮抗剂,从而增强大鼠的免疫反应有关,或者是共同作用以及谁占主导作用,还有待进一步研究。

参考文献:

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[9] Bonnet M. Lespinats G. Burtin C et al. Histamine and serotonin suppression of lymphocyte response to phytohemagglutinin and allogentic cells. Cell immunal.1984,83(2): 280-291.

[10] Buetin C, Scheinmann P, Salomon JC, et al. Decrease in tutor growth by injections of histamine or serotonin in fibrosarcoma-bearing mice: influence of H1 and H2 histamine receptors. Br J Cancer. 1982,45(1): 54-60.

[11] Siegel JN, Schwartz A, Askenase PW, et al. T-cell suppression and contrasuppression induced by histamine H2 and H1 receptor agonists respectively. Proc Natl Acal Sci. 1982,79(16): 5052-5056.

[12] 张瑾,王德昌. 组胺与恶性肿瘤的关系及抗肿瘤作用的研究. 中国肿瘤临床与康复,1999,6(2): 4-5.

(收稿日期2009-04-06)