Pitx3在帕金森模型大鼠黑质区表达情况的研究

2009-04-29 00:44:03
医药与保健 2009年6期
关键词:帕金森病

徐 海

[摘要] 目的 研究帕金森病(Parkinsons disease ,PD) 大鼠黑质区pitx3 基因的表达情况。方法将6-OHDA注入纹状体内制作PD大鼠模型,于不同时间点处死,观察pitx3基因的表达情况。结果同正常组、假手术组比较,PD模型大鼠损伤侧黑质区的pitx3基因在模型成功后第一周表达明显下降,15天后少量增加,30天后也未恢复到正常水平。结论6-OHDA纹状体内注射制作的PD大鼠模型中脑黑质区pitx3的表达明显下降与DA能神经元的死亡直接相关,2周后pitx3表达增加可能与自体神经干细胞的增殖与分化有关。

[关键词] 帕金森病; 黑质区;pitx3

[中图分类号] R742 [文献标识码] A[文章编号] 1004-8650(2009)06-019-02

The gene expression of Pitx3 in substantia nigra of rat model of Parkinsons disease

XU Hai

[Abstract] Objective To explore the gene expression of Pitx3 in substantia nigra of rat model of Parkinsons disease. Methods Rat model of Parkinsons disease was made by injecting the 6-hydroxydopaminin(6-OHDA)in the striatum. The rats were killed at different time points, and their brains were taken out. Using the methods of immunofluorescence, we deteded the gene expression of Pitx3 in substantia nigra of hemi-parkinsonian rats. Results Campared with the controls, the number of pitx3-positive cells was significantly decreased in the first week after PD models were set up, however, there was also a slight increase of pitx3-positive cells 15 days after and no further increase 30 days after. Conclusion The decreasing expression of Pitx3 in substantia nigra of PD rat model is probably related to the apoptosis of the dopaminergic neurons. Furthermore, the augmentation of pitx3 gene expression 15 days after may be associated with the proliferation and differentiation of neural stem cells in PD rat models.

[Key words] parkinsons disease ; substantia; pitx3

帕金森病(Parkinsons disease,PD)是常见的神经系统的退行性疾病,以震颤、肌强直及运动迟缓为主要临床表现,发病机制与脑内的黑质-纹状体系统多巴胺含量减少有关。研究PD模型大鼠黑质区多巴胺能神经元的死亡与再生具有重要的理论价值和临床意义。pitx3基因为垂体同源盒基因家族的成员之一,其表达产物pitx3[1-2]是决定中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元表型、终末分化和生存维持的关键性特异性转录因子。因此,本实验通过6-OHDA纹状体内注射制作PD大鼠模型,观察其脑内黑质区pitx3基因的表达情况。

1材料与方法

1.1PD模型的制作

雄性健康SD大鼠,体重200-250g,反复检测确认其无旋转行为。0.4%的戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,固定于立体定位仪上,常规消毒,开颅。立体定位坐标为两点:(参照Paxinos, Waston 大鼠图谱),第一点AP1 0.2,ML1 3,DV1 5.5用微量注射器缓慢注入6-OHDA(浓度3μg/μl)3μl,留针10分钟。提针至DV 4.5,进药3μl,第二点AP20.7,ML2 3DV25.5,进药过程同前。对照组定位点同前,注入等量的生理盐水代替6-OHDA。于术后第7天,腹腔内注射阿扑吗啡(APO)(5mg/kg),记录40分钟旋转次数,第一周偶有旋转,1-2转/min,第二周出现明显旋转4-5转/min,第三周稳定旋转7转/min或以上者视为成功模型。

1.2分组

取成功模型30只。分为模型成功后7d组(10只),15d组(10只),30d组(10只)。另选取正常组3只,对照组(注入生理盐水)6只。

1.3组织固定

所有实验动物深麻后心脏灌注肝素化的生理盐水150ml,继4%多聚甲醛灌注400ml。取全脑于4%多聚甲醛溶液后固定24h,入30%蔗糖溶液至沉底。

1.4组织切片

取中脑行冰冻冠状切片,切片厚度30μm。

1.5免疫荧光检测

冷冻切片置于PBS中洗5 min,然后用含0.3%曲拉通X-100的磷酸盐缓冲溶液 (phosphate buffer saline Triton X-100,PBT)室温下洗片30 min;再用10%山羊血清(用0.3%PBT配制),室温下封闭2 h。随后分别加一抗TH(1:500),pitx3(1:500)抗体, 4℃孵育过夜。0.3%PBT洗片后加山羊抗小鼠-FITC二抗(1:200),室温孵育半小时后4℃过夜,遮光。0.3%PBS洗片,甘油封片后照相。对照实验用0.01 mol/L PBS代替一抗。

1.6 统计学处理

免疫荧光显微镜观察标记细胞的表达:每只大鼠取相同序列切片6张,随机计数10个非重叠视野(400倍镜下),采用图像分析(OLYMPUS,DP Controller)计数阳性细胞。半定量数据和细胞计数资料用均数±标准差表示,所有数据采用SPSS10.0软件进行方差分析(ANOVA)。

2结果

黑质区pitx3阳性细胞的变化:正常大鼠中脑黑质区观察到较多的pitx3/TH双标细胞,pitx3/TH(免疫荧光检测显示胞质呈绿色荧光标记的TH阳性和胞核呈红色荧光标记的pitx3阳性双标细胞,细胞多数呈圆形或梭形,胞体较大,有长短不一的突起(图)。PD模型成功后7天,黑质区少见pitx3/TH双标细胞, 15天后稍有增加,30天后仍未见明显增加。见表1。

3讨论

中脑多巴胺能神经元在控制自主运动和精神活动中发挥着重要作用,研究其发育相关基因的调控是近年来发育神经生物学的热点之一。帕金森病导致多巴胺能神经元死亡,再生的神经细胞能否分化为多巴胺能神经元及其调控的机制一直是研究者关心的问题。本实验选用的是6-OHDA纹状体内注射制作PD大鼠模型,由于注入纹状体的6-OHDA须通过轴突逆行转运才能到达中脑黑质的神经元胞体,使得黑质内多巴胺能神经元的损伤呈现出一种渐进过程,更有利于模拟PD的发病过程[3]。本实验选取的7天,15天和30天的时间点能反映出多巴胺能神经元在脑内黑质区的表化情况。

pitx3基因由Semina和Smidt于1996年和1997年先后发现,属于垂体同源盒基因家族成员。现已确认,pitx3在胚胎发育的不同阶段表达在三种不同的组织内,在 E11-E18 d,转录因子pitx3 表达在中脑DA能神经元[4] 、晶状体和骨骼肌。多数研究表明pitx3在脑内仅在TH阳性神经元表达,与TH几乎同时开始表达,其表达和作用在脑内的定位局限而且特异,是决定中脑SN区DA能神经元表型、终末分化和生存维持的关键性特异性转录因子。

本实验观察到正常成年大鼠黑质中有较多的pitx3+/TH+细胞,排列紧密。成功制作PD模型后,伤侧黑质区的pitx3+/TH+细胞明显减少,在有的脑片上甚至观察不到,这主要是由于PD模型成功后第1周内,造成多巴胺能神经元的大量死亡所致。并且损伤对侧的黑质区pitx3+/TH+细胞也有少量减少。在PD模型成功后的第14天,可以观察到pitx3+/TH+细胞在黑质区少量增多,但相比正常大鼠仍然较少。30天后观察,损伤的黑质区的pitx3+/TH+ 细胞未见明显增加。有文章指出,PD大鼠模型成功后,海马区有大量的神经干细胞增殖[5],并可能迁移到黑质区,同时也有文章指出黑质区本身也可有少量的神经干细胞增殖,这些增殖的细胞在黑质区有可能转化为多巴胺能神经元。本实验结果观察到,在PD模型成功后的2周左右,有少量的pitx3+/TH+细胞出现。但是其具体的来源以及分化的机制并不清楚。

pitx3基因在DA能神经元发育中地位显要[6,7],从实验统计结果看,PD模型大鼠毁损侧中脑黑质pitx3基因的表达明显地下调,而且15天,30天后并没有明显的增加。尽管以前的研究结果证实了PD大鼠模型自体神经干细胞存在增殖的现象,但是从本实验结果可以看出自体增殖的神经干细胞仅仅有少数有可能转化为有功能的多巴胺能神经元。因此,怎样能够定向的引导新生神经干细胞的分化为多巴胺能神经元将是今后研究迫切需要解决的问题。

参考文献:

[1] Smidt M P, van Schaick H S, Lanctot C, et al. A homeodomain gene Pitx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons [J]. Proc Natl Acad Sci, 1997,94(24):13305-13310.

[2] van Den Munckhof P, Luk K C, Ste Marie L, et al. Pitx3 is required for motor activity and for survival of a subset of midbrain dopaminergic neurons [J]. Development, 2003,130(11):2535-2542.

[3] 赵焕英,苏月,等.6-羟多巴胺纹状体内注射制作大鼠帕金森模型的研究.中国组织化学与细胞化学杂志,2003 12(1):16.

[4] Maxwell S L, Ho H Y, Kuehner E,et al. Pitx3 regulates tyrosine hydroxylase expression in the substantia nigra and identifies a subgroup of mesencephalic dopaminergic progenitor neurons during mouse development[J]. Dev Biol,2005,282(2):467-479.

[5] 王磊,曾水林,李涛,等.帕金森模型大鼠海马区神经干细胞增殖情况的试验研究.军医进修学院学报,2005,26(3):21.

[6] Nunes I, Tovamasian L T, Silva R M , et al. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons[J]. Proc Natl Acad Sci, 2003,100 ( 7 ) : 4245-4250.

[7] Smidt M P, Smits S M, Peter J H, et al.Molecular mechanisms underlying midbrain dopamine neuron development and function [J]. Eur J Pharmacol, 2003,480(1-3):75-88.

(收稿日期2009-06-05)

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