XIAP表达在IIB期骨肉瘤早期预后的意义

杨运发 杜洪 黄蘋 王建炜 张光明 徐中和

基础研究

XIAP表达在IIB期骨肉瘤早期预后的意义

杨运发 杜洪 黄蘋 王建炜 张光明 徐中和

目的通过分析IIB期骨肉瘤化疗前活检标本XIAP的表达，探讨XIAP表达与IIB期骨肉瘤的早期预后预测的意义。方法应用免疫组化SP法检测31例IIB期骨肉瘤化疗前穿刺标本、10例正常骨组织标本XIAP的表达，并分析XIAP表达与各临床病理参数的关系。结果IIB期骨肉瘤化疗前标本均为XIAP高表达而正常骨为低表达或不表达；XIAP表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、大小、术前化疗肿瘤坏死率、局部复发等临床病理参数无关（P＞0.05），XIAP高表达与IIB期骨肉瘤远处转移（r=0.748,P=0.025）及最终成活（r=0.813,P=0.014）高度相关；IIB期骨肉瘤化疗前标本XIAP高表达者预后差。结论XIAP在IIB期骨肉瘤的发展中起重要的作用，化疗前活检标本的XIAP表达可作为IIB期骨肉瘤早期预后预测的指标。

骨肉瘤；细胞凋亡；肿瘤蛋白质类；抑制蛋白

研究证实X链锁的凋亡抑制蛋白（XIAP，X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein）是恶性肿瘤诸如胰腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌、膀胱癌、急性髓型白血病等的发生、发展的重要因素［1-5］。可能由于术前化疗的影响，XIAP在骨肉瘤组织中的表达却仍知之甚少，因此，我们设计从31例IIB期骨肉瘤化疗前活检标本来研究XIAP在骨肉瘤组织中的表达，以期揭示XIAP表达与骨肉瘤发展的关系。

1 材料与方法

1.1一般资料

2000年1月～2006年12月，共有31符合下列条件的IIB期原发性骨肉瘤患者进入本研究：（1）高分化骨肉瘤；（2）无远处转移；（3）未经任何治疗；（4）有活检标本。肿瘤部位：股骨远段16例，胫骨近段3例，肱骨近段3例，腓骨近段1例，股骨近段4例，骨盆3例，肋骨2例。治疗方法：保肢28例，截肢3例。31例患者均采用改良T10方案［6］在术前行2周期及术后至少4周期化疗，每一疗程均包括大剂量氨甲喋呤（MTX，8～12 g/m2，共2次）、阿霉素（adriamycin，30 mg/m2，1次）和顺铂（cisplatin，100 mg/m2，1次）。随访期从初次确诊起，至发现远处转移如肺转移或最后就诊止，最短随访时间为12月，平均随访时间为35月。患者最后情况由临床检查及X线检查等证实。在整个随访期内，12例死亡，19例无瘤存活；11例远处转移（肺转移或骨转移），转移出现在初次确诊后平均14个月，无任何肺转移患者行肺切除术。2例出现局部复发，复发率为6.45%。局部复发患者分别在复发后1个月和8个月出现肺转移。该31例石腊包埋的IIB期骨肉瘤化疗前活检标本由病理科医生进行再次确认。

1.2实验方法

采用免疫组织化学SP染色法。SP试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，一抗XIAP鼠抗人单克隆抗体（R&D公司）工作浓度为25 μg/ml。实验步骤严格按试剂盒说明书进行，主要步骤为：石腊切片脱腊至水，3%过氧化氢室温孵育10分钟，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，正常羊血清封闭20分钟，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明封片，中性树胶封固。选用已知的骨肉瘤组织XIAP表达阳性的标本作为阳性对照，以PBS代替一抗作为骨肉瘤阴性对照。

免疫组化结果判断：所有已染色的标本分别由2名病理科医生独立分析。XIAP染色以细胞核着色棕或黄色为阳性细胞判定标准，染色强度选用染色阳性的骨肉瘤组织作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，0分为蓝色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。随机观察10个高倍视野，计数1 000个细胞（如细胞数不足1 000，则计数实际细胞数）。阳性细胞数参照Kim等[4]研究骨肉瘤组织中ezrin表达计分的四分位计分方法进行计分，无阳性细胞为0分（阴性），阳性细胞≤25%为1分，25%＜阳性细胞≤50%为2分，50%＜阳性细胞≤75%为3分，阳性细胞＞75%为4分。将上述两者积分相加的最后得分作为XIAP表达强度（0～7分）：0分为不表达，1～5分为低表达，6～7分为高表达。

1.3统计学处理

临床病理学参数之间的关系包括XIAP表达、年龄、性别、部位、肿瘤大小（初次MRI肿瘤最长径）、化疗后肿瘤坏死率、局部复发、转移、最终结果等进行分析，所有数据均采用SPSS 11.0软件进行，任何可能影响预后的因素均采用双尾Kruskal-Wallis非参数检验，为确定各参数是否为独立危险因素，采用Spearman相关分析分析其相关性，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

XIAP主要在细胞的胞核中表达。已知强染色阳性的骨肉瘤切片作为阳性标准对照。在本研究中，几乎所有的骨肉瘤组织均为XIAP强阳性表达，而正常骨组织为阴性表达（图1）。XIAP高表达者与患者预后差独立相关，而与年龄、性别、部位、肿瘤大小、化疗坏死率、局部复发无关（表1～2）。XIAP高表达与肿瘤转移高度相关（r=0.748, P=0.025），并且XIAP高表达与患者最终结果也高度相关（r=0.813,P=0.014)。

3 讨论

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤之一。在新辅助化疗前，骨肉瘤的5年存活率仅约20%。随着影像诊断技术、外科手术特别是新辅助化疗的进步，骨肉瘤的5年存活率达到60%～70%，其临床效果仍不甚满意。

骨肉瘤疗效不满意的原因，可能主要是骨肉瘤肿瘤细胞对化疗等疗法不敏感所致。这些看似不同的治疗方法其实是通过相同的生物学机制即细胞凋亡的方式来消除肿瘤的[5]。在凋亡的调节因素中，凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是新发现的一类在结构上具有同源性的细胞凋亡抑制蛋白，是最强的内源性凋亡抑制因子，而XIAP是IAP家族中最有效的凋亡抑制剂。已证实XIAP表达与胰腺癌，卵巢癌，鼻咽癌，前列腺癌，膀胱癌，急性髓型白血病等的发生发展密切相关[1,2]。本研究中IIB骨肉瘤也几乎总是XIAP高表达，而正常骨低表达或不表达，说明XIAP也与IIB期骨肉瘤的发生和发展密切相关。

表1 XIAP表达与临床病理参数的关系

图1 XIAP表达（台盼兰染色，苏木素复染，×400）A已知的对照的XIAP强阳性骨肉瘤切片 B本研究中XIAP强阳性表达的骨肉瘤切片 C本研究中XIAP阴性表达的骨肉瘤切片 D平行对照的正常骨XIAP表达。.

表2 肿瘤转移、患者存活情况与各变量的关系

已证实众多因素如肿瘤坏死率、肿瘤大小、年龄、P-glycoprotin的过度表达和HER2/erB-2基因表达等并非总是与高分化骨肉瘤的预后相关［6］。在众多影响预后的因素中，目前应用最广的是肿瘤组织的化疗反应，即肿瘤的化疗坏死率。尽管已有很多研究证实肿瘤坏死率的预后预测价值，但其预测作用明显滞后，我们不可能在化疗前对该肿瘤的预后进行预测。化疗后肿瘤坏死率的预后预测的局限主要在于：（1）需2～3个月的时间判断坏死率；（2）在化疗前无从明了；（3）即便是化疗敏感者也不乏早期转移。因此，骨肉瘤的预后预测仍较困难。

与术前化疗后坏死率相比，应用未行任何治疗前活检标本的XIAP表达指标来预测骨肉瘤预后似乎更为简单和有效。本研究结果显示，IIB期骨肉瘤几乎总是XIAP高表达，而正常骨低表达或不表达，且XIAP高表达与转移和最终结果均高度相关。由于几乎所有的骨肉瘤化疗前活检标本均为强XIAP表达而正常骨标本仅弱表达或不表达，既然XIAP高表达者预后差，我们就可以通过检查XIAP表达及比较临床化疗反应预测其预后，还可根据活检时XIAP表达将骨肉瘤分组（XIAP高表达组与低表达组）来制定更为个体化的治疗方案，甚至可能通过这一做法进一步提高患者的存活率，比如针对XIAP较低表达者有更长的生存期，可采取更为积极的保肢治疗[7]。因此，化疗前穿刺标本的XIAP表达可作为IIB期骨肉瘤患者早期预后预测的指标。

1 Eckelman BP,Salvesen GS,Scott FL.Human inhibitor of apoptosis proteins:why XIAP is the black sheep of the family [J].EMBO Rep,2006,7(10):988-994.

2 Li M,Song T,Yin ZF,et al.XIAP as a prognostic marker of early recurrence of nonmuscular invasive bladder cancer[J]. Chin Med J(Engl),2007,120(6):469-473.

3 Meyers PA,Heller G,Healey J,et al.Chemotherapy for nonmetastatic osteogenic sarcoma: the Memorial Sloan-Kettering experience[J].J Clin Oncol,1992,10(1):5-15.

4 Kim MS,Song WS,Cho WH,et al.Ezrin expression predicts survival in stage IIB osteosarcomas[J].Clin Orthop Relat Res, 2007,459:229-236.

5 Meyers PA,Schwartz CL,Krailo M,et al.Osteosarcoma:a randomized,prospective trial of the addition of ifosfamide and/ or muramyl tripeptide to cisplatin,doxorubicin,and high-dose methotrexate[J].J Clin Oncol,2005,23(9):2004-2011.

6 Serra M,Scotlandi K,Reverter-Branchat G,et al.Value of P-glycoprotein and clinicopathologic factors as the basis for new treatment strategies in high-grade osteosarcoma of the extremities[J].J Clin Oncol,2003,21(3):536-542.

7 Yang YF,Zhang GM,XU ZH,et al.Structural bone allografts with intramedullary vascularized fibular autografts for the treatment of massive bone defects in extremities[J].J Med Coll PLA,2007,22(5):298-302.

（本文编辑 白朝晖）

XIAP expression and its predictive significance of prognosis in stage IIB osteosarcomas

Objective To evaluate XIAP expression in biopsy specimens from the patients with stage IIB osteosarcomas before chemotherapy and its predictive value of prognosis in this stage.Methods The expression of XIAP was retrospectively detected by SP immunohistochemistry in 31 biopsy specimens from stage IIB osteosarcomas before chemotherapy and 10 normal individuals.The relationship between XIAP expression and clinic-pathological features of the patients was analyzed.Results The osteosarcoma specimens showed strong cellular nucleus immunre-activity of XIAP compared normal bone specimens.High XIAP positive expression independently predicted the patient's poor outcome,and had no relationship with clinic-pathologic variables such as age,gender,location,tumor size,rate of tumor necrosis to preoperative chemotherapy,as well as local recurrence(P＞0.05).However significant correlations were found between high XIAP expression and degree of metastasis(r=0.748,P=0.025),and also final survival rate(r=0.813,P=0.014).Conclusions XIAP plays an important role in the development of stage IIB osteosarcomas and this expression before chemotherapy can be a early promising prognostic marker in the outcome of patients with stage IIB osteosarcomas.

Osteosarcoma;Apoptosis;Neoplasms proteins;Arrestin

R738.1

A

1674-666X(2009)01-0062-04

广州市医药卫生科技项目（2006-YB-017）

510180广州，广州市第一人民医院（广州医学院附属广州第一人民医院）骨科（杨运发,王建炜，张光明，徐中和），病理科（杜洪）；广州医学院附属荔湾医院外科(黄蘋）

E-mail：yyf701107@163.com

*YANG Yun-fa,DUHong,HUANG Pin,WANG Jian-wei,ZHANG Guang-ming,XU Zhong-he.Department of Orthopaedics, Affiliated Guangzhou First Municipal People's Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou,Guangdong 510180,China