农药克百威单链抗体基因构建及蛋白结构模拟

刘细霞 杨金易，2 王弘 庞杰 雷红涛 沈玉栋 孙远明

（1.广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广东广州，510640；2.中科院华南植物园；3.福建农林大学食品学院）

农药克百威单链抗体基因构建及蛋白结构模拟

刘细霞1杨金易1，2王弘1庞杰3雷红涛1沈玉栋1孙远明1

（1.广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广东广州，510640；2.中科院华南植物园；3.福建农林大学食品学院）

构建小分子农药克百威（CBF）单链抗体（scFv）基因，进行蛋白质二级、三级预测并对其理化特性进行分析。采用重叠延伸PCR方法，以能特异性分泌抗CBF单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3为原料，构建抗CBF scFv基因，进行测序，采用生物信息软件对氨基酸序列推导并进行结构预测，同时对理化性质进行分析。结果得出，抗CBF scFv基因全长750 bp，对应228个氨基酸，单链抗体分子量约为26315.1，等电点预测值5.66，为酸性蛋白质；二级结构显示抗克伦特罗单链抗体含α螺旋18处，β折叠108处，β转角24处，随机卷曲93处。三级结构建模显示VL和VH符合scFv的结构特点，可观察到6个环区形成疏水的“口袋”，具有抗原结合位点的空间构象。从而构建了一个抗CBF scFv基因，应用信息学技术所获得的预测和分析结果为抗克伦特罗单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供了大量的信息。

克百威 单链抗体 结构预测

克百威 （carbofuran，CBF，化学名2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯），商品名呋喃丹，是一种高效、广谱的氨基甲酸酯类杀虫剂，但因其对人和动物具有很高的毒性，并且不易降解，容易造成环境污染，国家农药残留标准中已规定其在粮食和蔬菜中不得检出，但违禁使用现象仍较严重。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点，在食品安全监测中具有突出的优势，其中高质量的抗体制备是关键[1～2]。

基因工程抗体为小分子农药快速低成本制备目的抗体提供了一条新的途径[3～6]。现有的研究表明，重组单链抗体（single chain Fv，scFv）能够保留与亲本单克隆抗体（MAb）结构相一致的抗原识别位点[7～12]。因此，构建目标抗体基因，对基因序列进行分析，并推导预测抗体的结构及理化性质对于重组抗体的进一步表达和在免疫检测中的应用具有重要意义。

本研究以CBF为对象，通过分泌高特异性抗CBL单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3，直接构建其scFv基因在此基础上对其编码蛋白的理化性质、二级结构、三级结构进行预测，为该基因进一步原核和真核系统的表达以及抗体的分子修饰改造提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗CBF单克隆抗体杂交瘤细胞株5D3由广东省食品质量安全重点实验室自建。pCANTAB5E vector购自美国大肠杆菌E.coli TG1，Trizol试剂购自Invitrogen公司；载体pCANTAB5E，辅助噬菌体M13KO7购自美国Amersham Biosciences公司；cDNA第一链合成试剂盒购自美国Promega公司；Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自美国NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自上海申能博彩公司；DEPC，dNTP购自广州威佳生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。Linker全长及引物由北京赛百盛公司合成。

1.2 试验方法

①总RNA提取 取1×106左右的对数生长期的抗CBF杂交瘤细胞5D3，加入1.5 mL TRIzol裂解液，彻底匀浆，室温放5 min，加300 μL氯仿，均匀振荡，室温放5 min，4℃，12000 r/min离心15 min，75%乙醇1 mL洗涤沉淀，4℃，5000 r/min离心5 min，去上清液，干燥沉淀，用DEPC处理的ddH2O溶解，70℃保存。

表1 各引物序列表

b.VL基因片段的扩增。取cDNA第一链反应物2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol/L）4 μL，VH（Back）引物（10 μmol/L）1 μL，VH（For）引物（10 μmol/L）1 μL，无菌纯水37～50 μL，涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应条件为94℃变性5 min，加入0.5 μL高保真Taq酶后，94℃，30 s；54℃，1 min；72℃，1 min；25个循环，72℃延伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收纯化，取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

c.VH基因片段的扩增。以VL（Back）（10 μmol/L）1 μL，VL（For）（10 μmol/L）1 μL为引物，PCR反应体系同上。PCR扩增反应条件为94℃变性5 min，加入0.5 μL高保真Taq酶后，94℃，30 s；60℃，1 min；72℃，1 min；30个循环，72℃延伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收纯化，琼脂糖凝胶电泳检测。

图1 VH、VL及scFv PCR扩增结果

图2 重组克隆PCR扩增鉴定

d.scFv拼接及扩增。重叠延伸法将VH和VL用Linker拼接起来。首先进行linker的预拼接：Linker1引物 （10 μmol/L）0.5 μL，Linker2引物（10 μmol/L）0.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，去离子水34.5 μL，反应溶液涡旋混匀，短暂离心。94℃预变性5 min，加入0.5 μL高保真Pfu酶，94℃，45 s；50℃，1 min；72℃，1 min；3个循环。在上面体系中补加VH 3 μL，VL 2.5 μL后，用枪轻轻混匀，94℃预变性5 min，补加0.5 μL高保真Pfu酶，94℃，45 s；50℃，1 min；72℃，1 min；30个循环，72℃延伸10 min。取4 μL拼接产物，加入10 μL 5×PCR Buffer，4 μL dNTP（2.5 mmol/L），RS（Back）、RS（For）各1 μL，无菌水30 μL，混合均匀，短暂离心后，94℃预变性2 min，加入0.5 μL高保真 Pfu酶，94℃，45 s；60℃，1 min；72℃，1 min；30个循环，72℃延伸10 min。取5 μL反应产物进行电泳检测。

图3 抗CBF单链抗体基因全序列

图4 VH、VL推导氨基酸序列

③scFv基因与克隆载体的连接和扩增 将5D3 scFv基因插入到pCANTAB5E载体中，转化感受态细胞TG1，挑选克隆，提取质粒，进行PCR扩增鉴定，并将克隆进行测序。扩增引物为R1，R2。

④抗CBF scFv结构分析 a.基因片段测序及氨基酸序列推导及比对。挑取经鉴定的重组克隆进行质粒抽提并送交Invitrogen公司测序。根据起始密码子“ATG”的位置，采用软件WinGene3进行氨基酸序列推导。同时，根据Kabat法则，对抗体可变区VH、VL的FR区及CDR区进行划分。将推导的氨基酸序列。

b.编码蛋白的理化性质分析。根据推导抗CBF单链抗体氨基酸全序列，采用ExPASy Proteomics tools在线工具中的ProtParam子程序对抗体蛋白的氨基酸组成、分子量、等电点等物理化学参数进行理论计算。

c.编码蛋白二级、三级结构预测。根据推导抗CBF单链抗体氨基酸全序列，采用ExPASy Proteomics tools在线工具中的SOPMA子程序对抗体蛋白二级结构进行预测，采用在线工具中的CPHmodels子程序对抗体分子的三维结构进行模拟。

2 结果与分析

2.1 抗体V区基因PCR扩增及鉴定

由图1可见，采用设计的引物，经PCR扩增，分别获得VH，VL片段，大小分别约为350 bp和320 bp。经重叠延伸法拼接、PCR扩增后，scFv的PCR产物约扩增出760 bp条带，与预期值相符。采用R1、R2引物对重组子进行PCR鉴定。R1、R2引物为载体上在多克隆位点两端所设计的引物。如果插入了长度为760 bp的scFv片段，则可以扩增出约1 Kb的DNA片段。随机挑取了8个克隆提取质粒进行PCR鉴定，如图2所示，其中4个含插入片段的约1 Kb条带。

2.2 抗CBF scFv结构分析

①scFv序列测定 抗CBF scFv序列全长为729个碱基（图3），其中VH长度为363个碱基，连接肽长度为45个碱基，VL长度为321个碱基。

②抗CBF scFv氨基酸序列推导 采用软件WinGene3进行氨基酸序列推导，重链可变区与轻链可变区推导的氨基酸序列以及FR区、CDR区的划分如图4所示。重链VH含121个氨基酸，轻链VL含107个氨基酸。从在CDR区发生变异的氨基酸分布看，变异氨基酸主要出现在VH的CDR2、CDR3区及VL的CDR1、CDR3区，提示这4个区的氨基酸组成可能与抗体识别CBF抗原密切相关。Abigail V Y C等[12]在对现有数据库中大量的抗体序列分析后也表明，VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR3四个区域的氨基酸组成主要影响抗体抗原结合位点的拓扑结构。

③抗CBF scFv结构及特性分析 根据软件预测分析，抗CBF单链抗体的二级结构含α螺旋18处，β折叠108处，β转角24处，随机卷曲93处。抗CBF单链抗体三维结构模拟图如图5所示。可见，三维模拟图符合典型scFv的结构，可观察到抗体可变区的6个环区（CDR区），共同组成抗体的抗原结合区。

另外，对抗CBF单链抗体理化性质的预测结果表明，该抗体分子量为26315.1，分子式为C1163H1762N308O373S9，等电点为5.66，酸性氨基酸残基为23个 （Asp+Glu），碱性氨基酸残基为22个（Arg+Lys），为酸性蛋白。因此如果采用离子交换法对此scFv进行纯化，可采用阴离子交换柱对此蛋白进行吸附纯化，也可采用阳离子交换柱对杂蛋白进行吸附来纯化。而采用凝胶过滤的方法进行纯化时则注意在26 kD的出峰时间处进行收集。

3 结论

本研究从抗克百威杂交瘤细胞中获得了抗CBF scFv基因，经测序，基因全长729 bp，其中重链VH为363 bp，轻链VL为321 bp，连接肽为45 bp。通过氨基酸序列推导，抗CBF单链抗体蛋白由228个氨基酸组成，抗体分子量约为26315.1，等电点预测值5.66，为酸性蛋白质，这些预测结果为抗克百威单链抗体基因表达、蛋白纯化和活性研究等后续实验提供了信息；并为抗体进一步改建、研究抗原抗体反应机制提供了一定的依据。

图5 抗CBF单链抗体三维结构模拟图

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Construction and Structure Prediction of Murine Single Chain Fv Gene against Carbofuran

LIU Xixia1,YANG Jinyi1,2,WANG Hong1,PANG Jie2,LEI Hongtao1,SHEN Yudong1,SUN Yuanming1

The gene of single chain Fv fragment(scFv)was constructed against carbofuran and the physical and chemical characteristics,secondary structure and tertiary structure of the scFv was predicted using computer assisted modeling.The variable region gene of the heavy and light chains were amplified respectively from 5D1 hybridoma cells that can secret monoclonal antibodies with high activity and specificity against carbofuran.These two fragments were then spliced together through a flexible linker to scFv by using splicing overlap extension(SOE)PCR.The scFv gene was named cbf and the sequence of scFv gene was measured.The physical and chemical characteristics,secondary and tertiary structure were predicted using Internet and corresponding software.The whole scFv gene contained 750 bp was cloned successfully and encoded 228 amino acids.Theoretically,the scFv was relative molecular masses 26315.1,the isoelectric point(pI)was 5.66 and the antibody belongs to acid protein.The predictied secondary structure showed the protein contained 18 α-helix,108 β-sheet,24 β-turn and 93 random coli.The mimic tertiary structure model of scFv indicted the linker was isolated from VH and VL.The VL,as well as the VH,was involved in composing the hydrophobic"pocket"which was beneficial to the antigen binding.The construction and analysis of scFv against carbofuran laid the foundation for the further research into expression,purification and bioactivity of the genetic engineering antibody.

Carbofuran;Single chain Fv(scFv);Structure prediction

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.16.027

国家自然科学基金（30871755，30400354），广东省自然科学基金（06025825），福建省科技重点项目（2008Y0006）

刘细霞，女，博士研究生，研究方向为食品质量安全，电话：020-85283448。E-mail:gzwhongd@163.com

王弘，通信作者

2009-08-03