２，７－二氯荧光素与蛋白质相互作用的分光光度法研究

于文萃　孙丽军

[摘要]采用分光光度法研究模拟生理条件下2,7－二氯荧光素与牛血清白蛋白的相互作用。结果表明：两者相互作用形成稳定的复合物，最大吸收波长为509n=，与2,7－二氯荧光素的最大吸收波长502nm比较，红移了7nm；二者之间主要通过静电引力结合，但不排除疏水作用力和氢键：二者之间的结合数为32。

[关键词]2,7－二氯荧光素牛血清白蛋白分光光度法

中图分类号：041文献标识码：A文章编号：1671－7597(2009)0210005－01

一、引言

光谱法由于方法简单、容易操作等优点是蛋白质与药物分子研究的主要方法，荧光素近年来得到广泛应用，本文采分光光度法对2,7－二氯荧光素与牛血清白蛋白的相互作用进行研究。

二、实验部分

(一)仪器与试剂

自动电位滴定计，78HW－恒温加热磁力搅拌器，UV-240IPC紫外光谱仪。牛血清白蛋白用pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液配制其储备液(7.7×10^-5mol·L^-1)，4℃保存于暗处；2,7－二氯荧光素，储备液用蒸馏水配制；1.0mol·L^-1氯化钠溶液用于维持体系的离子强度；三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲溶液(pH 7.4)，用0.2mol·L^-1的三羟甲基氨基甲烷溶液和0.1mol·L^-1盐酸溶液配制；实验用水为二次蒸馏水。

(二)实验方法

于10mL比色管中，依次加入NaCI溶液、2,7－二氯荧光素溶液、BSA溶液，用pH 7.4 Tris－HCl缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置10min。以相应的试剂空白为参比，室温下用1cm比色皿，在一定波长下测其吸光度。(1)固定BSA溶液浓度，改变2,7－二氯荧光素的浓度，在选定波长范围内扫描吸收光谱见图1－1。(2)固定2,7－二氯荧光素溶液的浓度，改变BSA溶液浓度。配制该系列溶液过程中发现：随着BSA溶液浓度的增太，溶液颜色由2,7－二氯荧光素的浅绿色，逐渐过渡到桃红色。在选定波长范围内扫描吸收光谱，见图2－2。

三、结果与讨论

(一)吸收光谱

图2－1为模拟生理条件下(pH 7.4 Tris－HCl缓冲溶液，离子强度1＝0.1)2,7－二氯荧光素对BSA吸收光谱的影响图。从图中看出：BSA在400－750 nm波长内没有吸收，随着2,7－二氯荧光素溶液浓度的增大，吸光度值增大，但谱线的形状基本保持不变，最大吸收波长也无明显移动。因此，不能说明BSA与2,7－二氯荧光素相互作用生成了复合物。因为吸光度的变化很可能是由于2,7－二氯荧光素浓度的不断增大而引起吸收程度的改变。为此，实验过程中又固定2,7－二氯荧光素溶液的浓度、改变BSA溶液的浓度，扫描混合物的吸收光谱图，结果发现：BSA的浓度为7.7×10^-6mol·L^-1时混合体系最大吸收波长发生了改变。据此，本实验研究了BSA溶液的浓度为7.7×10^-6mol·L^-1时与DCF的作用。图2－2为模拟生理条件下2,7一二氯荧光素与BSA作用前后的吸收光谱图。从图中看出：2,7－二氯荧光素的最大吸收波长为502nm，与BSA作用后最大吸收波长红移。由于BSA在该波段没有吸收，2,7－二氯荧光素的浓度变化只影响吸光度的变化，而不会使最大吸收波长发生移动，导致波长位移的因素只可能是2,7－二氯荧光素与BSA发生相互作用生成了复合物。综上所述得出结论：2,7－二氯荧光素与BSA在模拟生理条件下作用生成了复合物。由于在BSA的浓度为7.7×10^-6mol·L^-1时与DCF反应后最大吸收波长红移到509nm，故在摩尔比法中选择该波长为测定波长。

(二)2,7－二氯荧光素与BSA作用位点、作用力类型及结合数的研究

(1)2,7－二氯荧光素与BSA相互作用的作用位点的研究

本论文研究的2,7－二氯荧光素是一种有机小分子，结合分析我们推测：2,7－二氯荧光素与BSA相互作用主要是与BSA中的精氨酸、赖氨酸残基结合。

(2)2,7－二氯荧光素与BSA作用力类型的研究

本论文吸收光谱部分已论述了2,7－二氯荧光素与BSA发生相互作用是由于生成了复合物，这表明两者之间存在着作用力。从分子结构上看，BSA分子中存在着不同基团，如－H、－NH₂、＞C＝0等，2,7－二氯荧光素存在着＞C＝0、阴离子配体等。BSA分子中的－H与2,7－二氯荧光素的＞C＝0之间可能形成氢键：在水溶液中，BSA中的－NH^3＋与2,7－二氯荧光素的阴离子配体之间也可能存在静电引力；还有两者含有一些极性很差、疏水性较强的基团间也可能靠疏水作用力结合。在实验过程中还发现：配制系列不同浓度BSA溶液时，由于BSA浓度的增大，溶液颜色由浅绿色变成桃红色，这种现象的产生说明静电引力在BSA与2,7－二氯荧光素的结合中起关键作用。由此推测2,7－二氯荧光素与牛血清白蛋白主要靠静电引力结合，但不排除疏水作用力和氢键。

(3)结合数的测定

本文采用摩尔比法测定了2,7－二氯荧光素与BSA相互作用的结合个数。固定BSA浓度，改变2,7－二氯荧光素的浓度，在波长509nm处，以试剂空白为参比，测定吸光度值A。以吸光度值A对摩尔比作图，见图2－3。从图中可以看出：曲线中有折点出现。依据摩尔比法原理：折点所对应的比值正对应于每一个BSA分子所结合的2,7－二氯荧光素分子的数目。图中折点对应的值约为32，即是说每个BSA分子所结合的2,7－二氯荧光素分子的数目为32。

四、结论

模拟生理条件下，2,7－二氯荧光素与BSA作用后最大吸收波长发生红移，实验结果说明2,7－二氯荧光素与BSA作用生成了复合物。该论文探讨了两者相互作用的作用力类型和作用位点，并采用摩尔比法成功得到了两者相互作用的结合数为32。

作者简介：

于文萃，女，汉族，辽宁省丹东市人，助教，研究方向：化学工程。