人工神经血管化研究的进展

王 岚 邢 新 沈尊理

·综述·

人工神经血管化研究的进展

王 岚 邢 新 沈尊理

周围神经损伤后，缺损的替代修复是目前临床上尚未完全解决的问题。目前主要的修复方法是自体神经游离移植，该方法疗效较为肯定，但存在供体来源有限，且易造成供区感觉或功能障碍、神经瘤的形成、手术难度高以及轴突错位生长等问题。因此，应用人工神经移植物作为支架，修复周围神经缺损成为近年来周围神经领域的研究热点，并已取得了可喜发展。现在，不仅能在体外培养扩增多种种子细胞，而且能将培养的细胞与各种生物材料复合，植入体内以达到恢复周围神经功能的目的。然而，到目前为止，人工神经移植尚不能完全与自体神经移植的效果相媲美，如神经缺损超过一定的长度或所需修复的神经较粗大时，或有肌腱、骨外露等血供不良创面时，修复效果差。可能的原因为组织工程人工神经移植体再血管化延迟，在早期不能及时建立内在的血液循环，部分种子细胞由于缺血缺氧而死亡，影响神经再生质量。进一步的基础研究发现，细胞在血管周围150～200 μm内才能通过弥散来维持存活，否则移植体内部的细胞将难以通过渗透作用获得营养和氧分的支持。因此，组织工程人工神经内必须要有毛细血管的长入才能维持种子细胞正常的代谢[1]。目前，组织工程人工神经早期血管化问题日益受到学者们的关注。

1 周围神经再生与再生微环境及局部血供

周围神经损伤后，末梢侧靶组织分泌神经生长因子等生物活性物质，诱导中枢侧的神经出芽再生，神经轴突由近端沿许旺细胞鞘膜的方向渐次延伸，达到神经末梢。周围神经再生的调控是一个复杂的过程，由多因素共同参与。受损局部（包括近、远端的断端）会释放一系列内源性生长因子，促进神经再生。这些诱导和促进神经生长的因子包括，神经营养因子家族、轴突生长促进因子、作用于许旺细胞的因子等，它们是神经轴突生长、许旺细胞迁移生长并形成髓鞘所不可或缺的[3－4]。细胞外基质（ECM）如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等在细胞的粘附和移行过程中发挥重要的作用。层粘连蛋白是基底膜的成分之一，能够引导和促进轴突长入基底膜支架，同时促使巨噬细胞移出移植物。纤维粘连蛋白也能促进轴突再生并能够抑制成纤维细胞过度浸润。某些激素，如胰岛素、甲状腺素等也参与其中[5－6]。周围神经的血供有两种形式：即外部纵形血管和内部丛状血管。Hirasawa发现神经移植后，血管再形成有两种形式：神经外形式出现在移植后3～6周内，为纵形血管；神经内形式即丛状血管系统，可持续24周。不带血管的神经移植术后3 d为缺血状态，术后1周发生急剧的血流增加。而带血管的神经移植早期虽也有血流升高，但基本处于平稳状态[7－8]，这对于保持神经内微环境的恒定可能有一定意义。周围神经损伤后，轴突和髓鞘的溃变产物是吸引巨噬细胞聚集的主要物质[9]。来源于血液中的巨噬细胞能使移植体内残留的组织碎片得到较快清除，为轴突向远端生长打开通道[10]，为神经轴索再生，迅速长入Bungner带，提供了有利条件。带血管的神经移植的血流持续平稳，维持了许旺细胞的营养物质。调整局部神经再生的微环境，对促进神经再生十分重要，而这又与局部血供密切相关。

2 血管新生的相关机制

根据血管再生中内皮细胞的来源不同，可将血管新生（Neovascularization）分成血管形成（Vasculogenesis）和血管生成（Angiogenesis）两种形式。血管形成，指血管内皮细胞来源于其前体细胞，即内皮祖细胞（EPC）或血管母细胞，这种血管形成方式主要是指在胚胎发育时，由中胚层的成血管细胞发育成血管系统。血管生成，是指血管的生长来源于已经存在的成熟血管内皮细胞，通过出芽及微血管融合生长等方式来进行的。以往认为，血管形成只限于胚胎，血管生成只存在于成体，随着成体来源的EPC在体外分离成功，证明血管形成也发生在成体阶段，主要参与重症缺血区域血管的新生。

血管新生均由生长因子、细胞和细胞外基质（ECM）间的相互作用所调控的。生长因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素（Angiopoietin，Ang）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子β（TGF－β）、血小板衍生生长因子（PDGF）等。其中，VEGF和Ang是两种最重要的促血管生成因子，在血管的新生中二者协同作用，VEGF促进原始血管网的形成，而Ang则作用于随后的血管改建塑形，促进形成成熟且有空间结构的血管网。细胞外基质包括整合素αγβ3、基质－细胞蛋白、蛋白水解酶等可促进新生血管形成和稳定以及血管内皮细胞的迁移。

3 人工神经的血管化策略

3.1 人工神经导管材料的修饰

人工神经血管化的最终目的，是在导管内形成有功能的血管网。这就要求导管材料与血管内皮细胞有良好的组织相容性，并能促进毛细血管的长入[14]。对材料进行修饰，主要包括内部支架的建立和外部多孔状结构的构建。适宜的内外部结构可以支持种子细胞的分化和轴突再生，支持细胞的贴附，防止结缔组织长入，同时可以在导管表面固定添加一些促进血管内皮细胞粘附和增殖的物质如：胶原、纤维结合素、层粘连蛋白等。现在的人工神经导管一般选择孔隙率为70%，孔径20～40 μm的半渗透性导管，以利于血管的长入和营养物质的渗入[15]。

3.2 在人工神经导管内置入缓释的生长因子

在人工神经导管内置入缓释的复合生长因子，可以诱导血管内皮细胞向材料内部迁移、增殖从而形成毛细血管网。直接诱导血管内皮细胞分裂、增殖和迁移的生长因子主要有VEGF、FGF家族；体内能间接促进血管形成的生长因子有TGF-β、PDGF和Ang[16]。后者主要作用是促进血管周细胞和平滑肌细胞的分裂、增殖和迁移。

3.3 血管内皮细胞与种子细胞联合培养

血管内皮细胞种植在材料内可增殖分化形成血管。Sahota等[17]将人真皮微血管内皮细胞接种到可降解的支架上，植入裸鼠体内，1 d后发现内皮细胞在支架内迁移，5 d后形成毛细血管样管道，1周后形成了微血管，3周就与宿主的血管相连通。

3.4 体内血管网包裹

Zhang等[18]研究表明，大网膜脂细胞能合成血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，大网膜微血管内皮细胞能合成碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)。目前实验已证实，VEGF和bFGF是强有力的促血管生长因子[19－20]。周建生等[2]利用带蒂大网膜移位包裹人工神经移植体，在术后3 d出现再血管化，7 d、14 d再血管化程度逐渐增强，促进其早期再血管化。

3.5 血管束植入

为了改善移植神经的血供，1976年Taylor等提出了吻合血管的神经移植，应用带桡动、静脉的桡神经浅支修复正中神经缺损，取得了成功。但在临床上，由于带血供的血管化神经供区有限，1994年Cavadas等进行了植入血管束预制血管化神经的研究。张媛媛等[21]利用兔右耳的中央动静脉束植入面神经上颊支，人为地形成一条带血管的神经移植体，在神经移植过程中保持了血液供应的连续性，为神经轴索再生及迅速长入Bungner带，提供了有利条件。研究发现，实验组在术后6周、8周、10周，髓鞘厚度和神经纤维直径均优于对照组；术后神经传导速度恢复快，远端肌肉和运动终板恢复快，SDH和AchE升高迅速。神经血管束的植入方法相对血管网包裹而言可能具有更大的优点，比较符合生理上神经血供特点，植入材料内部后缩短了再血管化的距离和时间，而且可以形成以植入血管束为蒂的带蒂的人工神经。

3.6 体外构建血管网

1998年，Shinoka等[37]用Polyglatin/PGA制成管状支架，从羊颈总动脉或颈外静脉取EC、SMC、FB，体外培养2周后种植于支架上，继续孵育7 d后，细胞在支架融成片状，即移植于羊的肺动脉，11周后支架完全降解，管壁内胶原蛋白含量为正常自体肺动脉的73%左右，管壁中膜有弹性纤维生成，内膜有ES特有的Ⅷ因子存在；管壁中钙含量高于邻近的自体肺动脉，但无大块钙化组织出现。该实验中，PGA材料的机械支撑力较弱，可用于低压的肺循环，但置于压力较高的体循环中，则可能形成动脉瘤。1998年，L’Heureux等[38]分别将人脐静脉SMC和人皮肤下FB于培养瓶中培养，,30 d后形成由细胞和ECM构成的膜片，,将膜片从瓶壁上剥离，包裹在惰性管轴外继续培养。在成熟期，膜片相互紧密粘接，形成圆柱状培养物。将FB管膜经脱水处理后制成无细胞内膜，然后分步组装：先将内膜套在聚四氟乙烯多孔管轴(外径3 mm)外，再裹上SMC膜片制为中膜，此时将构制物置于生物反应器中，将培养液同时通过管腔和管外进行回流培养，然后再裹上FB膜作为外膜，最后取出中心管轴，于管内接种EC，于3个月后构制成具有活性细胞、有类似机体血管板层结构的组织工程血管。其中的SMC和EC均表现分化状态，血液相容性好，能耐受2 000 mmHg（7.5 mmHg=1 KPa）的静水压，其移植于体内的长期通畅率和稳定性等则有待进一步观察。在3个月时，胶原蛋白的含量为相应自体腹主动脉的25%左右，至5个月增加到99%；中膜有大量弹力纤维生成，内膜有平整的EC。随着时间延长，其机构拉力曲线逐渐与自体腹主动脉相一致，并且在中膜发现有金属蛋白酶(MMP22)，这是种明胶酶，可分解胶原蛋白，表明组织工程血管的胶原组织处于动态平衡的状态。2001年，熊猛等[39]将培养3～7代的牛主动脉的EC接种于PGA上，旋转动态培养10 d，结果形成较完整的内膜层，复盖率达91%左右，前列环素生成率为4.6%，培养血管的ECⅧ因子相关抗原抗体染色呈阳性，EC在管腔内表面贴附良好，细胞相互融合成片。

4 展望

目前采用的组织工程血管化的方法或多或少地存在一些问题，例如在材料内复合生长因子的使用量、缓释的速度调控、诱导形成的血管的成熟程度，以及种子细胞基因突变等安全性问题，都需要进一步的研究。利用宿主体内的血管进行血管化，因血管长入需要一定时间，导致构建组织的大小受到限制。体外构造血管网是一种非常有前景的方法，但其难度大，有很多的技术问题需要解决，比如如何获得非常大量的内皮细胞，形成的血管网在体外怎样保持其有效的生理功能等。相信随着对血管化的形成和调控机制分子水平的基础研究不断深入，以及各种技术手段不断发展、完善，最终会找到比较理想化的人工神经血管化的方法。

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Q813.1+3

B

1673－0364（2009）－01－0049－03

2008年7月24日；

2008年10月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.015

200080上海市上海交通大学附属第一人民医院整形科（王岚，沈尊理）；200433上海市第二军医大学附属长海医院整形科（邢新）。