腰椎间盘退变研究的方法学选择与评价（一）

廖鹰扬 刘少喻 邹学农

综述

腰椎间盘退变研究的方法学选择与评价（一）

廖鹰扬 刘少喻 邹学农

既往研究证实，腰椎间盘退变是下腰痛(low back pain)的主要病因之一，由椎间盘退变直接引起的下腰痛被称之为椎间盘源性疼痛（discogenic pain），其所导致的功能障碍正在耗费全世界大量的医疗资源[1]。就病因学而言，腰椎间盘退变的发病机理非常复杂，是在遗传易感性、衰老等自然因素和机械负荷、营养供应障碍等环境因素共同作用下逐渐形成的[2]。最新研究发现，在腰椎间盘退变的诸多危险因素中，遗传易感性因素仅占29%～54%，而营养障碍、机械负荷等后天因素对椎间盘退变的发病起着非常重要的作用[3]。对退变机理与病理变化的研究正不断取得进展，其成果将成为腰椎间盘退变生物治疗与再生医学的根本基础。因此，对腰椎间盘退变研究的方法学选择与评价，是进一步明确椎间盘退变发病机理、疾病转归和治疗效果评估的关键要素。

1 组织学评价方法

1.1 大体标本评分

Thompson评分系统[4]是目前广泛应用的组织形态学评价方法，主要描述椎间盘大体标本的病变范围与严重程度。基于髓核、纤维环、椎体终板与骨赘4个方面的病变，其严重程度被分为5级，可间接反映椎间盘退变病理过程中髓核与纤维环胶原纤维与蛋白聚糖的成分变化[5]。

1.2 常规染色方法

HE染色能够显示各层组织结构，是研究椎间盘组织形态的重要技术。正常椎间盘髓核由脊索细胞和软骨样细胞构成；纤维环由层状胶原结构组成，内层主要为软骨样细胞，外层为纤维样细胞。髓核细胞周围阿辛蓝染色阳性及纤维环层状结构的存在是椎间盘完整的标志[6]。在苏木精—伊红染色切片中，可观察到在退变早期，脊索细胞数量减少，软骨样细胞增加；随着退变发展，脊索细胞和软骨样细胞均减少，纤维环内死亡细胞数量增加，软骨内形成骨赘，髓核由胶冻样组织变成纤维软骨组织，体积缩小，纤维环层状结构紊乱，髓核和纤维环界限不清，椎间盘出现裂隙；退变晚期，脊索细胞完全消失，骨赘广泛形成，髓核突出纤维环[7]。

1.3 免疫组化技术

作为生化研究的常规技术，免疫组化方法可对组织内生化物质的改变进行定性定量分析。随着对椎间盘退变机理认识的不断深入，测定和分析椎间盘糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)、胶原含量和含水量被作为研究椎间盘退变的标准评价方法之一，能够有效地评价体内及体外实验研究中椎间盘的退变情况。Wuertz等[8]取新鲜椎间盘标本测量湿重，冻干24 h后测量干重，然后通过仪器测定GAG的含量。Le-Maitre等[9]运用免疫组化技术定量测定软骨形态发生蛋白（cartilagederived morphogenetic protein,CDMP）含量，结果表明，CDMP含量在正常髓核中明显高于退变髓核，在退变髓核中明显高于内层纤维环，而外层纤维环中的CDMP含量则低于髓核和内层纤维环；研究还发现，CDMP可以显著提高髓核与纤维环中GAG和II型胶原含量。这些结果提示CDMP在椎间盘退变中扮演调控细胞外基质合成的重要角色，无论在退变的差异评估、机理研究还是治疗干预方面均有广阔的应用前景。

2 分子生物学评价方法

2.1 基因表达分析

实时定量多聚酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）是研究基因学最重要的技术。当椎间盘发生病变时，细胞外基质、合成酶和分解酶等蛋白及其基因发生变化，椎间盘髓核与纤维环中的蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原等细胞外成分受基因调控，PCR技术能动态反映基因表达水平以及受基因调控物质的合成与分解代谢情况。

2.2 关于基因表达分析的各种评价参数

腰椎间盘退变的病理生理基础是椎间盘细胞基质合成和分解代谢的失衡。椎间盘的细胞外基质主要由抵抗张力的胶原和抵抗压力的蛋白聚糖共同组成，病变过程中细胞外基质成分的变化导致了细胞外基质生物化学、生物力学环境的改变，而后两者反过来又加速了细胞外基质成分的变化，同时各种细胞因子也起到了重要的作用。以下基质成分或细胞因子及其受体的基因表达水平的变化揭示了椎间盘退变的病理改变：（1）代表基质合成代谢的I、II、III、IV、V、VI、IX、X型胶原，弹性纤维，总蛋白聚糖（total proteoglycans），聚集蛋白聚糖（aggrecan），核心蛋白多糖（decorin）及纤维调节素（fibromodulin）等；（2）代表基质分解代谢的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）-1、2、3、7、8、9、13、19，带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS）-4及组织蛋白酶D、G、K、L等；（3）对抗基质分解代谢的金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP）-1、2、3等；（4）各种功能各异的细胞因子及其受体：bFGF、EGF、IGF-1、PDGF、TGF-α、TGF-β、BMP-RII、FGF-R3、IGF-RI、TGF-b-RII及EGF-R等；（5）各种炎症介质及其受体，如IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-1-RI、IL-1-Ra、IL-6-R、TNF-α等[10]。

2.3 上述评价参数在椎间盘退变发病机理研究中的应用

Cs-Szabo等[11]研究发现，人类椎间盘轻度退变时，蛋白多糖基因表达在纤维环内增加，在髓核内降低，而随着退变进展，其表达在整个椎间盘内均降低；椎间盘严重退变后，Ⅰ型胶原表达在髓核与纤维环内均明显增加，Ⅱ型胶原在轻度退变时增加而在严重退变后表达下调。Iatridis等[12]的动物实验研究表明，短期动态加压刺激椎间盘基质合成代谢的mRNA表达，而单纯制动则抑制基质合成代谢的mRNA表达。Wuertz等[8]研究显示，在振幅、频率约为0.2 Hz、0.2 MPa的水平上进行动态加压生物力学实验时，椎间盘基质合成的mRNA转录水平维持稳定；采用高于或低于此节点的振幅与频率进行动态加压则会导致相应mRNA表达的改变，分别对应椎间盘的重构、修复或退变。许多炎症因子，如IL-1β浓度增加可导致其他炎症因子的表型改变，还可直接抑制细胞基质的合成，并且通过正反馈环路刺激其他炎症介质与MMP等因子的合成，间接促进细胞基质的分解代谢[13]。

总之，椎间盘退变过程中基因表达的改变提示了基质细胞的多种功能变化，主要包括合成特定基质成分的代偿能力[14-15]、分解代谢能力[16-19]、对生长因子分泌的影响[13,20-23]以及导致炎症因子的出现[13,22-24]等。在这些研究中，基因表达分析可以预测、衡量GAG与胶原的合成分解代谢，动态反映其变化趋势。

2.4 椎间盘细胞凋亡研究中的基因表达分析

2.4.1 影响椎间盘髓核细胞凋亡的细胞因子 自1998年Gruber等[25]率先报道细胞凋亡在人类椎间盘退变中的关键作用以来，学者们[26-29]利用PCR方法对此进行了研究，结果显示，多种细胞因子可以影响椎间盘髓核细胞的凋亡。按作用机制可以将其分为促进髓核细胞凋亡的因子（IL-1、IL-6、NO、H2O2、TNF-α、Fas蛋白等）和抑制髓核细胞凋亡的因子（IGF-1、TGF-β1、rhBMP-7、bFGF等）。髓核细胞外基质由髓核细胞合成，因此以上这两类细胞因子可通过不同的作用机制单独或相互作用以改变髓核细胞外基质的合成/降解平衡，从而影响椎间盘退变，而这些细胞因子对髓核细胞外基质的作用最终影响髓核细胞的凋亡，因此评估这些细胞因子的基因表达水平对于阐明椎间盘细胞凋亡机理及退变过程有重大意义。

2.4.2 评价指标在研究凋亡通路中的应用 Park等[26]认为，椎间盘退变的细胞凋亡受Fas/Fas-L系统通路调控。Bachmeier等[27]发现，TNF-α系统在椎间盘退变过程中对细胞凋亡的发生起重要作用，Wei等[28]认为rhBMP-7可抵抗这一过程。Chen等[29]在对合并脊柱侧弯的退变椎间盘的研究过程中取得了与上述学者相似的结果，同时对DR5DcR2等受体蛋白进行了定量PCR分析，结果证实，椎间盘退变、突出过程中的细胞凋亡亦通过DR5/TRAIL通路调控。此外，IGF-1对抗细胞凋亡的效应与其剂量呈正相关，一般认为其机制是调节βcl-2/Bax平衡，并由此启动了两条信号传递通路：激活磷脂酰肌醇（phosphoinositide,PI）-3激酶，进而形成磷酸化磷酸肌醇（phosphoinositide phosphate,PIP）-3；激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）即有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路，从而抑制髓核细胞凋亡。

3 影像学评价方法

3.1 X线平片

X线平片检查费用低廉，应用简便，可以提供脊柱力线、椎体排列、畸形、不稳以及脊柱退变过程的间接征象，但衡量椎间盘退变时需观察椎间盘高度是否减小（是否存在椎间隙狭窄），而X线平片无法为诊断评估椎间盘退变提供直接的证据，因此仅能作为临床实验研究的筛选评价方法，或作为除外引起椎间盘退变原因的筛选工具[30]。

3.2 CT

相较于X线平片，CT检查被认为在诊断和评估椎间盘退变、突出的病理改变方面有更高的准确性[31]。通过断层扫描，CT可为椎间盘退变、膨出、突出等病理变化提供清晰的水平面图像，以作为诊断和评估椎间盘退变的直接依据；CT的密度分辨率较X线高20倍，能够清晰地显示椎体、椎管内、椎旁组织的结构细节，能够对图像进行三维重建，可以更好地为评价椎间盘退变提供继发性骨质增生、椎管狭窄、椎体滑脱等病理征象，因而在临床上得以广泛应用[32]。

3.2.1 CT椎间盘造影（computed tomography discogram,CTD）造影剂注入无退变的椎间盘时，借助液体流动和弥散作用逐渐与髓核混合；而在退变的椎间盘，造影剂充填在纤维化的髓核团块周围和纤维环裂隙内，并在椎间盘内沿生理或损伤撕裂的空隙均匀分布，从而为椎间盘退变提供准确的征象。尤其对于有慢性下腰痛病史、无典型神经根性症状和体征、CT平扫和MRI无腰椎间盘突出征象的病例，CTD是显示椎间盘破裂直接征象和明确腰痛是否为椎间盘源性的惟一方法。常规MRI仅能部分显示腰椎间盘破裂的间接征象，CTD则可明确显示腰椎间盘破裂[33]。Zhang等[34]对椎间盘退变患者MRI、CTD与组织学检查进行对比，结果发现MRI诊断椎间盘源性疼痛敏感性高但缺乏特异性，CTD特异性较高，可以用来确定“责任”椎间盘。目前，Adams分型及DDD分型（Dallas discogram description）均被认为是比较权威的CTD影像学评价方法[34]。

3.2.2 椎间盘造影相关诱发痛(discogram relative provoked pain,DRPP)在椎间盘造影剂注入病变椎间盘的过程中，许多患者被诱发出与腰痛发作完全相同或相似的症状。DRPP按其性质、程度和定位可分为与平时下腰痛完全一致的DRPP（复制性腰痛）以及与平时下腰痛不一致的DRPP两种类型。研究者们提出了DRPP发生机制的几种假说：（1）直接机械刺激说：椎间盘纤维环外层存在痛觉感受器与痛觉神经纤维，椎间盘内注入造影剂后压力增高，痛觉感受器受机械牵张刺激，由痛觉纤维传入中枢，产生腰痛；（2）间接机械刺激说：椎间盘内注入造影剂后终板受压增加，或压力通过终板传导至椎体引起疼痛；（3）化学刺激说：破裂椎间盘髓核内长入的无髓鞘神经纤维裸露在细胞外液中被炎症介质致敏，由注入的造影剂化学刺激引起疼痛[34,35]。

近年的研究结果表明，DRPP不仅源于椎间盘承受的压力刺激椎间盘内部压力传导器，同时也与椎间盘内部物质变化特别是炎症因子增加进而引起痛阈降低密切相关，从这个意义上讲，DRPP可分为压力型和接触型两类。Peng等[36]研究发现，椎间盘源性腰痛病人的椎间盘在组织学上表现为具有显著特征的从髓核至纤维环外层的血管化肉芽组织条带区，与CTD上显示的纤维环裂隙一致；免疫组化染色显示，P物质、神经丝蛋白和血管活性肠肽三种神经肽阳性神经纤维的分布数量和比例较正常椎间盘和生理性老化椎间盘明显增多。由此推断，椎间盘造影剂由髓核向后方流出到纤维环外层所产生的压力作用于肉芽组织中的神经纤维，是产生复制性腰痛的病理基础。

DRPP最初仅仅是在椎间盘造影中偶然发现的一种特殊现象。随着众多研究的深入，椎间盘造影术逐渐成为阐明椎间盘退变病理过程和椎间盘源性疼痛发生机理的关键研究方法，对椎间盘退变性疾病的诊断、临床干预措施的选择以及治疗效果的改善具有重要意义。

3.3 MRI

MRI检查时病人和工作人员无需暴露在X线辐射下，对于评价相邻节段中纤维环撕裂、软组织水肿以及无症状椎间盘退变与膨出方面较CT优越，尤其适用于观察髓核与纤维环、硬膜囊与周围软组织之间的关系。磁显葡胺增强显影通常用于常规MRI示椎间盘退变阴性而临床上又高度怀疑的病例。对于无症状椎间盘退变的病例，增强显影具有更高的阳性检出率，还可用于椎间盘术后瘢痕组织和复发性椎间盘突出的鉴别诊断。

以往MRI相较于CT的不足之处主要表现在：断层间隔大，检查不够精细，容易遗漏细节；对骨质微细解剖结构、椎管狭窄病变的显示不如CT[32]；对骨化增生缺乏信号；体内带有某些金属或起搏器的患者不宜做MRI检查等。但随着成像序列、驰豫参数、高场强MRI、高分辨魔角旋转(high resolution magic angle spinning,HRMAS)核磁共振技术的研究和发展，以上这些相对于CT的劣势正逐步发生转变甚或成为优势。

在椎间盘退变的MRI影像学研究中，最重要而又亟需解决的难题就是如何将影像学改变与下腰痛发生、发展之间的关系以及其与生物化学、分子生物学、组织病理学改变联系起来，以揭示其发病机理并指导临床治疗。既往研究中正是由于影像技术未能有效地显示椎间盘病变过程中细胞、神经的改变，更无法阐明椎间盘源性疼痛发生的机理[37]，因此临床医生常常认为影像学检查本身并不能直接反映临床情况[38]。而在过去20年中，许多学者在这方面做出了不懈地努力，取得了令人鼓舞的进展[16,39]。

3.3.1 MRI与临床、组织病理学变化、分子生物学参数及生物力学特征之间的内在联系 Boos等[40]在1.5T磁场强度上证实了T1、T2在椎间盘退变研究中的可重复性，进而对有下腰痛症状和无症状的椎间盘退变患者的T1、T2加权像进行对比分析，发现有下腰痛症状组T1、T2弛豫时间明显缩短。Benneker等[41]在尸检过程中对39例患者的腰椎间盘取样，对回旋序列扫描参数、三维重建图像数据、相关生化指标（如含水量、蛋白多糖含量等）以及形态学评分等做线性回归分析，发现T2信号强度、Modic改变、椎间盘高度、终板硬化、骨赘形成、Schmorl’s结节、椎间盘内钙化等影像学量化参数分别与水含量、蛋白多糖含量、大体形态学评分显著相关。Chiu等[42]的研究结果显示，退变椎间盘中髓核与纤维环之间的表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)存在显著差异，且ADC与Thompson评分、椎间盘负荷成反比。Antoniou等[43]发现椎间盘ADC与GAG含量、水含量同步降低，与胶原、胶原酶消化引起髓核降解的结果相一致。Hsu等[44]在扩散张量成像的研究中证实了扩散系数的各向异性（fractional anisotropy,FA）可能与胶原纤维的方向有着潜在的联系。Schultz等[45]研究表明，椎间盘MRI图像Pfirrmann评分与基质生物力学参数改变以及组织学观察中的薄层状结构密切相关。

3.3.2 对T2加权像退变椎间盘后部高密度带（high intensity zoom,HIZ）的研究 1992年Aprill等[46]首先报告在MRI上显示的腰椎间盘纤维环后方HIZ与下腰痛病人行CTD时的阳性结果有相关性。Stabler等[47]发现，这种束带状的高密度带与血管形成有关，被认为是纤维环撕裂的结果，它的出现与下腰痛的发生具有高度一致性。Peng[36,48]等的最新研究显示，HIZ仅出现在3级以上的退变椎间盘中，而存在HIZ的椎间盘在造影时出现诱发痛，特异性为100%。这个结果提示，如果下腰痛病人T2加权像存在HIZ，则表明该椎间盘是疼痛的“责任”腰椎间盘。传统上认为CTD是诊断纤维环破裂时椎间盘源性疼痛“责任”椎间盘不可替代的方法，但上述研究结果表明，行MRI影像学检查的下腰痛患者在退变椎间盘后部T2加权像出现HIZ的特征性改变，无创、简易、特异性更高，有望取代术前CTD。

3.3.3 对MRI量化评估序列的研究 MRI生理成像与量化分析技术是科学、客观地评估椎间盘退变不可缺少的手段，有希望用以监测椎间盘形态学改变之前的早期退变和疾病发展过程。衡量组织水合作用的测量方法，如T1、T2与T1ρ弛豫时间测定，成为近年来研究的热点。Weidenbaum等[49]的早期研究发现，1/T2与椎间盘水含量呈负相关。Chatani等[50]研究表明，在髓核与纤维环之间，T1、T2弛豫时间均有显著差异，而T1弛豫时间与髓核、纤维环的含水量呈线性相关。自旋锁定T1ρ成像技术主要用于探测活动受限的水分子在蛋白多糖等基质大分子中的缓慢运动及其交互作用，近5年来被广泛用于四肢与脊柱软骨的研究中[43,51,52]。Johannessen等[51]应用1.5 T场强的MRI扫描仪，设定自旋锁定时间为15～75 ms，对腰椎间盘标本进行连续扫描，量化分析发现T1ρ与蛋白多糖含量之间有显著的相关关系，而T1ρ与年龄、含水量以及T2与蛋白多糖含量呈中度相关。Keshari等[52]研究证明无论在髓核还是纤维环中，T1ρ与Thompson评分之间均呈反比关系。线扫描扩散张量成像（diffusion tensor imaging,DTI）能够提供人类脊柱中的高质量扩散加权图像以及FA图谱，通过特定的方法计算ADC值，因而被认为是一种很有前途的量化分析方法[53]。以往DTI一般只能在高场强超导磁共振成像仪器上进行，从而限制了这一重要诊断手段的临床应用，由于近年来低场强磁共振仪DTI成像获得成功，且与高场强仪器上的相关数据相符合，因此，DTI在椎间盘退变量化研究中的应用将越来越普遍[54]。

3.3.4 HRMAS技术 在以往的MRI影像学检测中，由于仪器的信噪比低，固体分子不能自由运动，自旋之间的耦合较强，13C在外磁场中有各种取向，造成吸收峰很宽（FA宽峰），掩盖了其他精细的光谱谱线结构，因此分辨率很差。HRMAS技术通过样品的旋转来达到减少分子相互作用的目的，使上述问题得以解决，从而达到降低误差和干扰、提高分辨率的目的。Keshari等[55]应用HRMAS技术对不同Thompson评分分级的退变椎间盘进行测量，发现它们之间有着显著的化学成分差异。在纤维环，羟脯氨酸与氨基乙酸的含量随着Thompson评分分级增加而稳定增加，乙酰基化合物的含量则变化不定；在髓核，没有发现羟脯氨酸与氨基乙酸含量的稳定增加，却发现乙酰基化合物含量稳定下降。随着HRMAS的进一步应用，可以采用光谱分析方法在体内试验中准确地分析椎间盘的生物化学和分子生物学变化，因而在评估椎间盘退变中的应用前景光明。

上述对腰椎间盘退变评估方法的研究，主要目的在于探索疾病的发生机理与观察病理变化的发展过程。得益于分子生物学、生物化学及影像物理学等相关学科的迅猛发展，研究者可以在细胞水平、亚细胞水平测定不同生化分子与重要功能分子的改变及其相关基因表达，以此阐明腰椎间盘退变的发病机理及其病理变化过程，从而提出新的临床治疗与干预方法。

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（待续）

（本文编辑 白朝晖）

R681.5,R323.4

A

1674-666X(2009)02-0144-07

10.3969/j.issn.1674-666X.2009.02.019

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