百子莲的再生体系试验初报

康 玲

摘 要:以百子莲(Agapanthus africanus)的根茎部和叶片为外植体进行离体培养,以MS 为基础培养基,附加不同浓度的植物生长调节剂诱导根茎部直接再生不定芽;同时以百子莲幼嫩叶片和种子进行组织培养作对比试验。结果表明,成熟的根茎接种在添加BA 4.0mg/L 和NAA 0.1mg/L 的MS培养基上不定芽分化率达最高,平均外植体不定芽个数在10个以上。将叶片分别接种到添加不同浓度2,4-D和MS+BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L的培养基中,结果没有诱导出不定芽。诱导百子莲生根实验表明IBA对百子莲的生根没有促进作用。

关键词:百子莲;离体培养;根茎

百子莲又名非洲百合,是石蒜科、百子莲属植物。产于南非,为一庭园花卉,广州和北京有栽培。与花名相符的蓝紫色或白色花朵浪漫诱人,细细的筒状花向四周绽放,似高贵而优美的女性,由于欧洲人偏爱蓝紫色系,故英国园林中栽培极广,近些年来在世界各国被广泛应用于切花生产、园林美化、药用成分提取等方面。我国引入百子莲属植物的时间不长,科研成果缺乏,对其组织培养繁殖技术还未见报道。百子莲是以分株和播种为现阶段最主要的繁殖方式,但繁殖的速度慢,时间长。目前为了加快百子莲的繁殖速度,缩短繁殖的周期,对百子莲进行离体培养,可以大量且快速地进行繁殖。同时,对百子莲的离体培养,建立高效稳定的离体再生体系,为百子莲的分子育种提供理论基础和实践经验。

本研究为百子莲的组织培养的初步研究,对百子莲不同的外植体进行参照培养,参考了火焰卫矛生根培养基为1/2MS+NAA 012mg/L。试验最后得到一些初步结果,为百子莲的离体快繁、无病毒苗木培育等奠定基础,丰富了自身基础理论,并且在实际生产中也会提高生产效率和经济效益。

1 材料与方法

1.1无菌外植体材料的获得

以2008年9月在河北农业大学标本园采收的百子莲(品种A. praecox ssp. minimus ‘Storms River)饱满种子为实验材料。将所取材料先用清水冲洗干净,在超净工作台上用70%的酒精消毒30秒,再用0.1%升汞溶液消毒种子3分钟,最后用无菌水冲洗3~4次。将消毒完毕的种子接种于没有附加任何植物激素的培养基,约1周后种子膨大发芽,2~3周时将幼苗的根系从根颈处切掉,切取根颈及叶片用于不定芽的诱导。

1.2不定芽的再生

将切掉根系的小苗及叶段(长1cm),接种到含不同植物激素浓度及组合的MS培养基上(激素配比见表2),所有培养基中均附加3%蔗糖及0.6%琼脂,调节pH 5.8~6.1,121℃条件下高温蒸气灭菌15 分钟。每个处理最少接种50个外植体,重复3次。接种6周后统计不定芽分化率及外植体平均不定芽个数。

1.3叶片愈伤组织的诱导

将叶片切成长约1cm的小段接种在MS附加不同浓度2,4-D(表3)的培养基上,以诱导愈伤组织。

1.4再生苗的生根

当不定芽长到3cm左右时,从基部切割下来,转接到附加不同浓度IBA的生根培养基中进行生根培养。统计其生根率并观察其根系的生长状况。

1.5培养条件

所有培养均在以下条件下进行:温度25±2℃,光照强度:1500~2000Lx,光照时间:14 小时光照,10 小时黑暗。

2 结果与分析

2.1无菌苗的获得

将经过消毒的百子莲种子放入MS基本培养基中,约5天开始膨大,再过约20天长成2~3cm的小苗。由表1可知,该品种发芽率比较高,但发芽不整齐,接种的第7天,只有少量的种子萌发,随着发芽时间的延长,发芽率逐渐提高,当接种3周左右时,其发芽率达到最高,为90%。出现此种情况可能和种子的饱满度有一定的关系,在以后的实验中还需加强对种子整齐度的进一步筛选。

2.2不定芽分化的形态观察

本研究中以根茎和叶片为外植体,但只有以根茎外植体的诱导中形成了不定芽,以叶片为外植体,没有愈伤组织形成,也没有不定芽。当根茎外植体接种2周后,其基部开始膨大,接种3周时有大量白色愈伤组织形成,接种4周时,有少量不定芽开始出现,继续培养至6周时,有大量不定芽开始形成。伴随不定芽大量形成,也有叶片生成。

2.3不同外植体、不同激素及浓度配比对不定芽形成的影响

将百子莲根茎和叶片接种于附加不同植物生长调节物质的培养基上进行愈伤组织和不定芽的诱导。由表2可知,不同外植体的不定芽再生能力有很大差异。不同浓度的KT和NAA组合根茎、叶片为外植体均没有不定芽的形成。但不同浓度的BA与0.1mg/L NAA结合,均有愈伤组织及不定芽的形成,当BA浓度为1.0 mg/L时,其不定芽再生率仅为39%,外植体平均不定芽数只有4个,生成2~3片叶;随着BA浓度的提高,不定芽的再生率快速上升;当BA浓度为4.0mg/L时,不定芽的再生率达到最高,为95%,一般生成5~7片叶,外植体平均不定芽数目也达到最多,大多在12个以上;但当BA浓度再增加时,不定芽的再生率及外植体平均不定芽数目反而均有所下降,因此4.0 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA是百子莲不定芽最佳的诱导体系。

2.4叶片愈伤组织诱导

以百子莲的叶片为外植体接种在含有不同浓度的细胞分裂素和生长素的培养基上,没有不定芽的形成,也没有出现愈伤组织。为了建立以叶片为外植体的再生体系,试验中再次以2,4-D作为主要生长调节剂来诱导愈伤组织的形成。本研究将细嫩的叶片切成约1 cm长的小段,接种到含不同浓度2,4-D(1mg/L, 2 mg/L, 4 mg/L和8 mg/L)的培养基中,但是各处理均没有任何反应(数据略),可见百子莲的叶片对植物激素的反应极不敏感,因此,还有必要进一步研究以叶片为外植体,其愈伤组织和不定芽再生所需的最佳条件。

2.5不定芽生根诱导

当根茎上再生的不定芽长到约3cm时,将其从基部切下转入附加不同浓度IBA(0.5 mg/L、1.0 mg/L和2.0 mg/L)的生根培养基中,诱导其生根(表3)观察发现,接种30 天时,各处理中依然没有不定根形成,可见IBA对百子莲的生根没有促进作用,其最佳的生根体系还有待于进一步研究。

3讨论

目前有关百子莲近缘植物再生体系的研究有:朱顶红(Hippeastrum)蓝百合(Praeco ssp.orientalis ‘Big Blue)唐菖蒲(Gladiolus),研究表明,不同种间对外源植物激素诱导效应明显不同。本试验初步成功建立了百子莲根茎离体再生体系,并发现百子莲根茎离体再生受许多内外因素的影响。外部因素如培养基成分、植物激素的浓度及配比等对不定芽的分化影响不同,其中激素的种类和浓度尤为重要。如添加NAA+BA的培养基和添加KT培养基上的根茎有明显的差别:添加NAA+BA的培养基无论是愈伤组织诱导率还是芽诱导率都明显高于添加KT培养基。内部因素如植株的基因型、年龄、外植体的种类、生理状态及大小等均影响植株的再生。一般供体植株年龄小、发育阶段年幼的外植体容易再生植株。百子莲不同部位通过离体培养最后结果各不相同:根茎部愈伤组织诱导率很高,叶片愈伤组织诱导率为0,也没有不定芽出现,分析认为,可能是百子莲的叶片对植物激素的反应比较迟钝,也可能是我们的试验组合较少,因此,还有必要对其再生所需要的条件进一步探索。

在本次诱导不定芽生根的实验中,使用的是IBA。许多研究证明,生长素是试管苗诱导生根最重要的影响因子,它对不定根的分化是必需的。生长素影响酶的活性,增加了原生质透性,降低了原生质粘性,使代谢活动加快,核糖核酸合成加强,这一系列重要生理生化变化有利于不定根的发生和生长。较常使用的生长素主要有IBA,NAA,IAA。其中NAA对生根的作用十分强大,其启动能力比IBA高3.7倍。IBA的作用虽弱,但不易被过氧化物酶分解,对生根有良好的效果。IAA在植物组织培养中使用的较少,因为植物组织中存在吲哚乙酸氧化酶,专门氧化分解IAA,因此本研究中未用到IAA。不过使用IBA,百子莲组培苗生根比较困难,三个不同浓度的处理均没有形成不定根。因此,在随后的试验中应以多种生长素如AA、 IAA做为百子莲生根的生长素进行探索。

(收稿:2009-07-27)