小型昆虫蛋白图谱检测方法的比较研究

褚　栋　张柱亭　安志兰　郭笃发　周洪旭

摘要：以烟粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]和温室白粉虱[Trialeurodes vaporariorum(westwood)]小型昆虫为研究对象，比较了这些小型昆虫可溶性蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测方法。结果表明，改进的复合银染法在蛋白质检测中具有效果好、简单快捷的特点。

关键词：烟粉虱；温室白粉虱；可溶性蛋白；复合银染法

中图分类号：Q 599

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是蛋白质分析中最常用的手段之一。SDS-PAGE分离后的蛋白质条带，通常用考马斯亮蓝进行染色，但是该方法灵敏度相对不高，背景较深。20世纪70年代产生了一种更为敏感的染色方法——银染法。近几年，又相继报道了许多改进的银染方法，包括二胺银染法、无二胺银染法、照相银染法、负片银染法、正片银染法和海波银染法。目前，对染色方法改进主要集中在如何提高蛋白质染色的灵敏度，操作方便与否，费用是否昂贵等方面。如何在保持银染方法高灵敏度的同时，又能够有效地降低染色背景，用无毒的化学物质去替换现在凝胶电泳中常用的有毒物质等，代表了蛋白质条带染色的未来发展方向。

在昆虫蛋白电泳染色方面，已有研究表明海波银染法在家蝇幼虫蛋白电泳中具有效果较好、简便快速的特点。而对于小型昆虫可溶性蛋白电泳检测的染色方法报道较少，该方面的研究对于小型昆虫物种鉴定、生理代谢等研究具有重要的实用价值。本研究以北方两种小型昆虫烟粉虱[Bemisia tabaci(Genadius)]和温室白粉虱[Trialeurodes va po-rriorum(Westwood)]作为研究对象，分别使用了常规考马斯亮蓝染色法、海波银染法、改进的复合银染法(考马斯亮蓝染色后再用海波银染法染色)3种方法进行了比较研究，结果表明改进的复合银染法得到的胶片底色浅、条带清晰、检测灵敏度高、相关性好，是一种较好的染色方法。并使用这种方法对烟粉虱、温室白粉虱成虫的生理代谢进行了初步比较研究。

1材料与方法

1．1供试虫源及寄主植物

烟粉虱室内继代饲养，供试植物茄子由本实验室种植。温度为(27±1)℃，相对湿度(RH)为70％～80％，光周期为L∥D=14 h∥10 h。温室白粉虱为田间苘麻种群。

1．2可溶性蛋白的制备及SDS-PAGE

取1头粉虱成虫置于PCR管中，用15 μL蒸馏水做裂解液，粉碎后4℃，12 OOO r／min离心15 min，取上清液作为蛋白质待测液。凝胶采用Tris-HCl缓冲体系，分离胶浓度为15％，pH=8.8；浓缩胶浓度为4％，pH=6.8；两种凝胶均为过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)系统化学聚合而成。以0.05％的溴酚蓝作为电泳前沿指示剂。分段控制电压，开始电泳时电压为120 V，当待测液进入分离胶后电压改为200 V，待溴酚蓝指示剂接近分离胶底部约1 cm时停止电泳。考马斯亮蓝法测定单头粉虱成虫蛋白量，重复5头，测定3次。

1．3不同染色方法的比较

电泳结束后，将同一块胶纵剖成3块，分别用以下方法进行染色：(1)考马斯亮蓝染色；(2)海波银染法染色；(3)考马斯亮蓝染色后再用海波银染法染色(复合银染法)。其中，考马斯亮蓝染色法步骤为：取下胶片做好标记，在摇床上染色(染色液：0.25 g考马斯亮蓝G2₂₅₀，100 mL乙醇，25 mL乙酸，用蒸馏水定容至250 mL)约30 min。回收染剂，用蒸馏水冲洗蓝色胶片，再倒入200 mL脱色液(400 mL95％乙醇，100 mL乙酸，用蒸馏水定容至1 000 mL)脱色，如此脱色数次至蛋白带显现。

1．4单头粉虱可溶性蛋白的图谱比较

分别取单头烟粉虱成虫、温室白粉虱成虫可溶性蛋白进行SDS-PAGE，然后利用复合银染法进行染色，并对染色后的图谱进行比较。

2结果与分析

2．1不同染色方法效果比较

利用不同的方法对烟粉虱、温室白粉虱可溶蛋白(分别3.811、6.276 μg)SDS-PAGE染色，结果见图1。从电泳图谱可以看出，用考马斯亮蓝染色得到的胶片条带少，且不清晰，背景较深(图1a)；用海波银染法染色后得到的条带比考马斯亮蓝染色得到的要多，但是底色仍然比较重，影响条带的清晰度(图1b)；用复合银染法所得条带多、底色轻、条带清晰，效果最好(图1c)。

2．2复合银染法在两种粉虱可溶性蛋白图谱分析中的应用

利用SDS-PAGE技术对1头烟粉虱、温室白粉虱成虫可溶性蛋白图谱进行比较(图2)。烟粉虱和温室白粉虱在蛋白质迁移率(Rf)为0.355和0.383位置分别有一条明显的特征性蛋白带，可作为区分两物种的依据。

3结论与讨论

考马斯亮蓝染色法和银染色法是蛋白质凝胶电泳两种最主要的染色方法。考马斯亮蓝染色法灵敏度较低，银染色法比考马斯亮蓝染色法的灵敏度约高出100倍，但在应用中显色太快，稳定性和重复性较差。近年来，海波银染法在昆虫家蝇幼虫蛋白电泳中不仅效果较好，而且简便快速。本研究将该方法融入了传统的复合银染技术中，不仅具有传统复合银染技术的高灵敏度特点，而且具有简单快速的特点。利用这种方法，1头烟粉虱的1／2溶液(约1.900 μg)也可染出清晰图谱。因此，本研究中的试验方法，可能在小型昆虫的蛋白电泳图谱分析中具有较高的应用价值。