甘蔗花叶病抗病性鉴定接种新技术研究

李文凤　黄应昆　卢文洁　罗志明

摘要：研究了甘蔗花叶病抗病性鉴定的一种新技术甘蔗生长期切茎接种法。此法和传统苗期手指摩擦接种法相比，接种后发病率极显著地高于手指摩擦接种法，且发病均匀、结果稳定，可以有效地区分不同甘蔗品种(材料)之间对病害的抗感性。比较11个甘蔗品种材料生长期切茎接种法和田间自然感病法对srMV-HH1的抗性鉴定，结果表明：两种方法发病率呈正相关，且相关程度极密切，相关系数达0.999 7，鉴定所得的抗病性和抗病等级结果完全一致，说明切茎接种法鉴定结果能真实反映甘蔗品种材料的自然抗感性；此外该方法简便实用、可操作性强、接种工效高，因此可以对大批量材料进行鉴定和筛选。

关键词甘蔗花叶病；接种新技术；生长期切茎接种法

中图分类号：S 435．661

甘蔗花叶病是一种重要的世界性甘蔗病害。近年来，该病在我国福建、广东、广西、四川和浙江等蔗区普遍发生，目前已成为云南蔗区发生最为普遍，危害最为严重的主要病害。全省年发病面积达6.67万hm²以上，其中严重发病面积达3.3万hm²以上，且有逐年扩展蔓延加重危害之趋势。感病品种，发病严重田块发病率高达100％。甘蔗感病后一般造成10％～40％的产量损失，糖分下降。其病原复杂，可由马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)、高粱花叶病毒(Sbrghum mosaic virus，SrMV)、玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)、约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)、玉米花叶病毒(Zea mosaic virus，ZeMV)、甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)等6种病毒单独或复合侵染引起。此病主要靠蚜虫、带病蔗种和蔗刀等收砍工具传播。国内外大量的研究表明：对甘蔗花叶病最经济有效的控制方法，就是选用抗病优良品种。因此对甘蔗种质资源进行抗性评价、筛选优良抗源以指导培育抗病品种成为育种学家和植病学家共同的重要目标。优良抗源的筛选工作必须以数量多、范围广的甘蔗种质资源抗性评价为基础，因此急需研究建立一套快速简便、致病性稳定、规范、实用的抗性鉴定技术。

目前甘蔗种质资源对花叶病的抗性鉴定方法有大田病圃鉴定、田间自然感病鉴定和人工接种鉴定。它们各具有优点和局限，大田病圃鉴定和田间自然感病鉴定是最为普遍、直观的方法。但其鉴定周期长、占用土地面积大、鉴定材料数量有限；而且由于病圃和田间中的自然病原及种类分布不均匀、气候和传播媒介等环境条件变化常常会影响鉴定结果的真实性、稳定性和准确性。人工接种鉴定快速简便、鉴定材料数量不受限制，且环境条件可人为控制，可以满足大规模筛选抗源材料的需要。目前常用的人工接种方法有喷雾接种法、手指摩擦接种法。喷雾接种法主要用于大批量材料接种，手指摩擦接种法则用于小批量材料接种。但两种方法都需要在接种时用手工搓揉蔗叶制造伤口，由于不易掌握搓揉力度，往往导致搓揉伤口不均匀，从而使接种后发病不均匀，致病性不稳定，影响鉴定结果。此外，由于甘蔗叶片表面布满毛群，叶缘锯齿尖利，人工摩擦(搓揉)易划伤手，也给具体操作带来困难，导致接种工效低。鉴于此，本研究在现有的、普遍采用的苗期接种技术基础上，研究建立了甘蔗生长期切茎接种鉴定法，并与苗期手指摩擦接种鉴定法和田问自然感病鉴定法结果进行比较。

1材料与方法

1．1供试甘蔗品种材料

供试甘蔗品种从本所脱毒健康苗圃选择粤糖79-177、台糖134、川糖61-408、粤糖89-240、云蔗89-151、桂11、Co281、cp31-588、拔地拉、ROC10、ROC22等品种无病健壮蔗株，各品种蔗株分别切成双芽苗，在流动冷水中浸泡48 h之后，用(50±0.5)℃热水处理2～3 h，再用80％敌敌畏和50％多菌灵可湿性粉剂1：800液浸种5～10 min，然后分别种植在塑料桶内，置于防虫温室，常规栽培管理。

1．2接种病毒源及接种液准备

病毒源取自云南省农业科学院甘蔗研究所李文风等从甘蔗上分离鉴定的高粱花叶病毒强致病性分离物SrMV～HH1(另文发表)，繁殖保存在甘蔗品种云蔗89-151上。

接种前取幼嫩的病叶组织剪细后，加3倍量(V／W)浓度为0.1 mol／L，pH为7.2的磷酸缓冲液(含0.2％Na₂SO₄)，研磨成匀浆，双层纱布过滤，滤液即为病毒接种液。

1．3鉴定方法

1．3．1手指摩擦接种法

选择甘蔗苗期阴凉的傍晚进行接种。撒适量500～600目金刚砂于病毒接种液中，搅拌混匀，以拇指和食指尖沾湿接种液，紧捏供试甘蔗小苗基部，加压轻轻搓揉至擦伤蔗叶表皮，重复接种3次，每次间隔7 d，每个品种接种20株。

发病率调查方法：首次接种7 d后，开始调查发病率，以后每隔15天调查1次，直至发病率稳定为止。调查记录接种日期、接种苗数、病害症状始现期、累计发病丛数。

分级标准：参照文献[6]的标准按1～5级分级进行抗性水平分类(表1)。

1．3．2切茎接种法

甘蔗生长期进行。用锋利刀片或枝剪把甘蔗植株地上部分沿土表快速切去，再用滴管吸1滴病毒接种液滴入留下的地下蔗头创面上，每品种接种20株，之后用报纸盖住遮光24 h后揭开。

发病率调查方法：接种20 d后，开始调查发病率，以后每隔15天调查1次，直至发病率稳定为止。调查记录接种日期、出苗数、病害症状始现期、累计发病丛数。

分级标准：同1．3．1。

1．3．3田间自然感病法

选择本所甘蔗花叶病易于发生和传播的田块设置自然感病试验观察田。上述11个供试品种，每品种种植2行，行长5 m，为1小区。小区间种植1行病蔗(云蔗89-151)，作为病原，各小区随机排列，重复3次。

发病率调查方法：种植50 d后，开始调查发病率，以后每隔30天调查1次，直至发病率稳定为止。调查记录种植日期、出苗数、病害症状始现期、累计发病丛数。

分级标准：同1．3．1。

2结果与分析

2．1两种接种方法接种效果比较

通过比较两种接种方法甘蔗花叶病的接种效果，结果发现(表2)：11个供试材料中，除Co281两种接种方法都未致其发病外，其余10个材料甘蔗生长期切茎接种法发病率均比手指摩擦法高，且发病显著、发病均匀。以其发病株率作百分数显著性t测验，p＜0.01，表明切茎接种法的发病率极显著地高于手指摩擦接种法。

2．2切茎接种法与田间自然感病法对SrMV-HH1抗性鉴定结果比较

比较11个甘蔗品种材料生长期切茎接种法和田问自然感病法对SrMV-HH1的抗性鉴定，结果发现(表3)：两种方法发病率呈正相关，且相关程度极密切，相关系数达0.999 7；根据1．3．1的分级标准，11个材料两种方法鉴定所得的抗病性和抗病等级结果完全一致，说明切茎接种法鉴定结果能真实反映甘蔗品种材料的自然抗感性，因而可以替代田间自然感病法鉴定。

3小结与讨论

甘蔗抗花叶病鉴定是甘蔗抗病育种的一个关键环节，而室内人工接种鉴定甘蔗对花叶病的抗性是抗花叶病鉴定的一个重要组成部分，具有快速和鉴定材料数量不受限制，环境条件可人为控制，可以满足大规模筛选抗源材料的优点。室内人工接种鉴定可大批量筛选抗源、使育种工作者及时了解掌握育种材料的抗感性，从而合理选配亲本组合、选育出抗病优良品种供生产上推广应用。由于目前常用的两种室内人工接种方法(喷雾接种法、手指摩擦接种法)都需要在接种前用手工搓揉蔗叶制造伤口，因不易掌握搓揉力度，往往导致搓揉伤口不均匀，从而使接种后花叶病发病不均匀，致病性不稳定，影响鉴定结果；此外，甘蔗叶片表面布满毛群，叶缘锯齿尖利，人工摩擦(搓揉)易划伤手，也给具体操作带来困难。

本研究研制出的甘蔗仡叶病接种新技术－甘蔗生长期切茎接种法，通过和常用的接种技术比较，具有以下特点：(1)接种后甘蔗花叶病发病显著、灵敏度高，可以有效区分不同甘蔗品种(寄主)之间对病害的抗感性；(2)运用切茎后在切口处点病毒液的接种方法，制造的伤口均匀，接种病毒量一致、接种后发病均匀、结果稳定性好；(3)由于带毒收砍工具(蔗刀等)交叉感染是甘蔗花叶病传播的主要途径，而生长期切茎接种法与此种传播方式很相似，因此鉴定结果更接近于田间自然感病结果；(4)生长期切茎接种法快速简便，不用人工搓揉甘蔗叶片，不易划伤手，因而可操作性强、接种工效高。因此可以对大批量材料进行鉴定和筛选，为育种和生产部门提供更多更广泛的抗源材料。