枇杷花腐病病原物的初步鉴定

瞿付娟　窦彦霞　肖崇刚　董国菊

摘要：经调查发现，在重庆发生的枇杷花腐病症状有2种类型：干腐型和湿腐型。通过病原菌形态特征、培养性状和致病性测定，初步鉴定这两种症状分别由拟盘多毛孢菌[Pestalotiopsis eriobotrifolia(Guba)Chen et Cao]和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)引起。枇杷花腐病害的发生与环境湿度有关，且湿度越大，病害发生越严重。

关键词：枇杷；花腐病；病原鉴定；湿度

中图分类号：S 436．6

枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lind.]为蔷薇科常绿乔木果树，原产中国，栽种历史悠久。近年来，枇杷在重庆的种植面积不断增加，随着生产规模日益扩大，枇杷上相继暴发各种病害，尤其是枇杷花腐病的发生，严重制约了枇杷的正常生产。据调查，花腐病带来的后果是灾难性的，严重时发病率可达97.4％。引起枇杷花腐的病因，郑少泉等认为在花期或果实成熟期，枇杷灰霉病可发生，病原菌为Botrytis cinerea Pers；肖宇等认为灰霉菌不是引起花穗腐烂的关键性致病病原菌，认为是在花腐病的中后期腐生上去的；但到目前还没有比较详细的研究报道。为进一步掌握枇杷花腐病害发生发展规律，明确引起病害发生的主要病原种类，笔者在2004年9月至2006年12月对重庆枇杷进行了全面的调查研究，现将结果报道如下。

1材料与方法

1．1枇杷花腐病标本来源

2004年9月至2007年1月期间，在重庆九龙坡、合川、永川、壁山等6个大型枇杷生产基地，采用系统抽样和随机采集相结合的方法调查枇杷花腐病病害发生情况，并以大五星枇杷为例，在同一田间，每月随机抽取大五星枇杷10株，调查枇杷花腐发病情况与当地空气湿度的关系。其中当地空气的湿度由干湿球温度表测得。

1．2 病原菌的分离

选取不同采集地新鲜且具典型症状的枇杷花腐病花枝，对其进行常规组织分离纯化，分离的菌株经单孢纯化后保存于PDA斜面上，置4℃冰箱中贮存备用。

1．3病原菌致病性测定

采用离体花枝接种法。在枇杷开花季节，采集感病品种大五星的健康花枝，插于盛水三角瓶中，每日换水1次，用孢子悬浮液(5×10²个／mL)进行喷雾离体接种，在25℃连续光照的条件下进行保湿培养，以清水作为对照，共设置90枝枇杷花枝重复。保湿24 h后，观察发病情况。根据柯赫氏法则，对发病花朵进行再分离，显微镜下观察分离得到的病原菌是否与原接种菌株相同。

2结果与分析

2．1田间调查

200 4年9月至2007年1月期间，在枇杷花盛开季节，共调查枇杷1 086株，其中株病花率达到50％的有519株，且不同品种花腐病发病程度不同。其中大五星及龙泉一号品种的枇杷花穗腐烂最多，在调查的246株大五星枇杷和213株龙泉一号枇杷发病率分别达到63.1％和62.7％，说明大五星和龙泉一号为易感花腐病的品种；同一品种在不同湿度下发病程度也不同(图1)。图1是以大五星枇杷为例，用Excel软件对所得数据进行统计分析，绘出的2004年9月至2007年1月期间枇杷花腐病每月发病率和月平均湿度图。结果表明，凡雨季来临早或雨量大或雨日多的年份，湿度大，发病早，传播蔓延快，危害严重。特别是在2004年9～12月雨水特别多，湿度大，此时正值枇杷开花之季，重病果园区发病率高达99.7％，形成有花无果，直接影响了枇杷的座果率；而2006年重庆干旱严重枇杷花腐发病率明显降低。

2．2病害症状

在9月下旬，花腐病就开始危害枇杷花蕾，调查发现花腐病症状有2种类型。一种是干腐型：花轴表皮变褐，再沿花轴逐渐向整个花蕾扩展，从花轴变褐部分至花朵皱缩干枯呈萎蔫状，后脱落，在后期花朵脱落后，花轴和花朵基座上产生黑色小点(图2a)，经镜检黑色小点是分生孢子盘及分生孢子(图2b)。另一种症状是湿腐型：花轴组织软腐，呈粑烂状，湿度大时，上面常有灰色霉状物出现。花蕾发病，病斑灰黑色，可阻止花开放，病蕾变褐枯死，花受侵害时，部分花瓣变褐色皱缩腐烂。在温暖潮湿的环境下，灰色霉层可以完全长满受侵染的部位(图2c)。

2．3病原菌培养性状

无论从新鲜的枇杷花腐病组织中分离纯化，还是采用病花枝上孢子挑取进行分离纯化，结果一致，且都得到2种菌：记为PF-1和PF-2。现将其特征分别描述如下：

PF-1在PDA上培养时，菌丝体绒状松软，早期呈轮纹状。培养8～10 d后，菌丝体上产生分生孢子盘，分布于整个菌落(图3a)；分生孢子盘(图3b)呈球形，直径150～280 μm，顶端有墨汁状黏液即产生的分生孢子；分生孢子成熟后直立或稍弯曲，广梭形，长17.9～24.8μm，宽6.4～8.1 μm，具5个细胞，长22～26 μm，中间3个细胞有色，长14～17 μm，分隔处不具显著缢缩；顶部细胞短而无色，基部细胞较小；有鞭毛3根，有时仅有2根，长16.8～30.1 μm；柄长2.97～7.01 μm(图3c)。PF-2在PDA平板上培养形成淡褐色菌落，气生菌丝稀疏，易产孢，在PDA能形成菌核，直径2.5～6.3 mm，单生，圆形至长圆形(图3d)。肉眼可见的灰棕色霉层就是该菌丝体和分生孢子梗及成堆的分生孢子，分乍孢子梗淡褐色不分支，可进行1～5级的亚分支，和主轴呈变化较大的锐角，顶端明显膨大，梗粗长(图3e)；分生孢子葡萄状堆集在梗末端，单孢，卵圆或侧圆形，末端稍突。无色至淡橄榄色，大小8～14 μm×6～9 μm(图3f)。

2．4病原菌致病性测定

在接种病原菌PF-1的30枝枇杷花穗中，第3天出现花轴表皮变褐病症的有23株，发病率达到76.7％，一旦花轴变褐，变褐部位扩展速度很快，第4天，花朵皱缩干枯呈萎蔫状，第6天，花朵脱落，第8天，变褐部位和脱落后的花朵基座上产生黑色小点。在试验过程中，对照均未发病。

在接种病原菌PF-2的30枝枇杷花穗中，第3天出现花轴表面腐烂病症的有19株，发病率达76.7％，第4天花朵变褐，皱缩。第6天花朵腐烂，花轴至花朵长满灰色霉层。在试验过程中，对照均未发病。

无论病原菌PF-1还是病原菌PF-2的接种试验均表明，病斑同原分离菌所在病斑形态特征一致，且从接种菌产生的病斑再次保湿和在PDA培养基上分离培养后显微镜观察，其结果仍为原分离菌，因此证实了原接种菌株为致病菌。

2．5病原菌的鉴定

根据上述菌株的形态特征，结合致病性测定，并参照相关文献，确定病原菌PF-1为拟盘多毛孢[Pestalotiopsis eriobotrifolia(Guba) chen et

Cao]；病原菌PF-2为灰葡萄孢(Botrytis cinereaPers.)。

3结论与讨论

通过跟踪调查重庆枇杷花腐病害的发生，发现湿度越大，枇杷花腐病害发生越严重，从病理角度分析，病原物与寄主的接触和侵入都和湿度及雨水等气象条件有关，绝大部分靠气流传播的真菌，湿度越高对病原菌的侵入越有利。因此，盛花期的阴雨天气是导致花腐病发生的重要环境因素。

拟盘多毛孢属及相关属是从盘多毛孢属分离出来的。值得提出的是，拟盘多毛孢属及其相邻属的分类目前依然处于比较混乱的局面。传统的拟盘多毛孢属分类多数以Guba的检索表为依据，该检索表包含了前人发表过的种，但种间特征模棱两可，steyaert年建立了拟盘多毛孢属(Pesta-lotiopsis]，他将原广义盘多毛孢属(Pestalotia)中分生孢子具5个细胞，中间3个细胞深色的种归入Pestalotiopsis中。Sutton和Nag Raj先后对拟盘多毛孢属的特征作不同的界定，两个分类系统矛盾的焦点在于对拟盘多毛孢属和截盘多毛孢属等属的界定不同，韦继光等通过分子系统学研究证明sutton界定的属间特征是合理的。即拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)分生孢子具有5个细胞，顶端多根附属丝，附属丝不分支或非二叉分支；截盘多毛孢属分生孢子4个细胞，具有多根顶端附属丝。陈国贵等鉴定出引起枇杷叶片灰斑病的病原菌是盘多毛孢属。按照其病原菌形态描述特征，陈家云认为引起枇杷灰斑病的病原菌是拟盘多毛孢[Pestalotiopsiseriobotrifolia(Guba)Chen et Cao]。因此本试验参照上述鉴定标准及从分离的代表菌株的形态、培养性状和致病性测定进行综合分析认为，引起枇杷花腐病干腐症状的病原菌为拟盘多毛孢[Pestalotiopsis eriobotrifolia (Guba) chen etCao]。枇杷花腐病在我国的报道很少，陈福如等报道在花穗成熟期灰葡萄孢菌可侵染，而肖宇等仅仅报道枇杷花腐病可能是由拟盘多毛孢菌引起的，本文首次全面报道引起枇杷花腐病的病原菌为拟盘多毛孢(P.eriobotrifolia)和灰葡萄孢(B.cinerea)，为枇杷花腐病害防治打下了理论基础。本文为该项研究的部分试验结果，今后将对该病的生物学特性和综合防治作进一步研究。