１５种植物源化合物对马铃薯茎线虫的活性比较

闫　磊　肖　婷　牛洪涛　于天丛　罗万春

摘要：利用离体生测方法，系统测定和比较了15种植物源化合物对马铃薯茎线虫的活性。结果表明，dl-薄荷醇和香茅醇等10种化合物对马铃薯茎线虫具有较高的活性；选用6种高活性化合物对马铃薯茎线虫的毒力测定结果表明：处理24 h和48 h后6种化合物的LC₅₀由小到大的顺序分别为：油酸＜间苯三酚＜间苯二酚＜柠檬酸＜dl-薄荷醇＜香茅醇；油酸＜间苯二酚＜香茅醇＜间苯三酚＜柠檬酸＜dl-薄荷醇。

关键词：植物源化合物；马铃薯茎线虫；活性

中图分类号：S 482．51

马铃薯茎线虫(Ditylenchus destructorThorne，1945)，是农作物重要病原线虫，主要为害马铃薯块茎和甘薯块根，我国过去一直将其列为对外检疫对象。除了马铃薯和甘薯外，它还能为害豌豆、花生等，但在我国主要为害甘薯，可引发甘薯茎线虫病。甘薯是山东、河北、河南等北方地区的重要作物。当前甘薯生产亟待解决的突出问题是防治分布广泛的甘薯茎线虫病，又俗称糠心病，受害甘薯一般减产20 ％～30％，严重的达70％～80％，甚至绝收，是甘薯上的一种毁灭性病害。

如今，甘薯茎线虫病的防治主要依赖化学防治，目前广泛使用的药剂主要有辛硫磷、克百威、苯线磷、甲基异柳磷、灭线磷、涕灭威等。而涕灭威凭借其防治成本低，防效及增产效果好的特点，被广泛推广使用。但这些应用防治的药剂以高毒和剧毒产品为主，对人畜极不安全，并且对环境造成了很大污染。而植物源杀线虫剂来源于自然界，在环境中易降解，对人类安全，具有良好的环境相容性，已越来越受到人们的重视。目前已报道的具有杀线虫活性的植物源化合物约有10多类100余种，表明在环境友好杀线虫剂的研究与开发中该类化合物具有很大潜力。本文系统测定和比较了文献已报道的具有杀线虫活性的15种植物源化合物对马铃薯茎线虫的活性，以加深对此类化合物的认识并为其选择性开发提供理论依据。

1材料与方法

1．1供试化合物

15种供试植物源化合物见表1。

1．2供试线虫的分离培养

供试线虫为马铃薯茎线虫(Ditylenchus de-structor)，将采集到的病薯(甘薯)用自来水冲洗干净，剖开病薯，用刀切成薄片，然后用镊子将病薯撕成小块，在漏斗底部铺上两层餐巾纸，将切好的病薯小块放人漏斗中加入无菌水，下面用带止水夹的橡胶管相连，每隔12 h左右打开止水夹用烧杯接取橡胶管中下部的液体备用。

将分离到的线虫用无菌水洗出，冲入无菌的指形管中，用0.5％的次氯酸钠消毒2 min，然后用无菌水冲洗2～3遍，使线虫自然沉降或用离心机使线虫快速沉淀(6 000 r／min，3 min)。再在离心管中加入各约500 mg／kg的链霉素(100万单位／g)，保持1 h，离心后吸出消毒液。再用无菌水冲洗3遍，定容到一定体积放在4℃冰箱中保存备用。在PDA(约20 mL)平板中接入灰葡萄孢(Botrytis ci-nerea Pers)，25℃温箱中暗培养。待菌丝长满整个培养皿后，在培养基中央刻一小口，加入消毒过的马铃薯茎线虫约500条。将培养皿用封口膜(Para-film)包好，正置放入25℃温箱中黑暗培养。接种培养2～3 d后将培养皿皿盖朝下放置，继续培养35～40 d，将培养皿皿盖上的线虫用无菌水冲洗到烧杯中备用。

1．3室内毒杀活性测定(药液浸泡法)

参照万树青使用的浸渍法进行。将15种化合物用丙酮(溶于水的则用无菌水)配制成一定浓度的母液备用。将同样体积(V₁)的线虫悬浮液注入24孔细胞培养板的样品孔内，再根据试验浓度[按式(1)计算]需要补充添加的无菌水(V₂)，最后加入相应量的药剂母液(V₃)，混合均匀后置于27℃培养箱中。每处理4次重复，每重复50～100条线虫。处理后24 h与48 h分别检查各处理的线虫死亡／存活情况，按式(2)和式(3)分别计算线虫死亡率和校正死亡率。

式中：V=线虫悬浮液体积V₁+补充无菌水体积V₃+药剂母液体积V₃，试验中N是事先设定的；为保证处理线虫数量的一致性，V₁也是固定的，如V₁=100 μL；No是已知的，那么将V固定，一般V=400 μL。据此可以得出不同处理的V₂、V₃。

2结果与分析

2．1供试化合物对马铃薯茎线虫的室内(离体)活性测定结果

按1．3药液浸泡法对马铃薯茎线虫进行室内生物活性测定(试验浓度为2 mg／mL)。试验中设空白对照(根据预试验，当丙酮与甲醇浓度低于20％时，对马铃薯茎线虫无显著影响)。测定结果见表2。

由表2结果可以看出：药剂处理后24 h，dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、柠檬酸、间苯二酚、间苯三酚、槐胺碱、野靛碱、槐定碱和槐果碱这10种化合物对马铃薯茎线虫表现出强烈的毒杀活性，线虫的校正死亡率均达89％以上，其结果与其他各处理问存在显著性差异，其中dl-薄荷醇的校正死亡率最高，达99.78％；另外，具有中等杀线虫活性的处理为苦豆碱和苦参碱。

药剂处理后48 h，各处理的防治效果有了一定的变化，dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、柠檬酸、间苯二酚、间苯三酚、槐胺碱和野靛碱这8种化合物仍对马铃薯茎线虫表现出强烈的毒杀活性，线虫的校正死亡率均达89％以上，其结果与其他各处理间存在显著性差异，其中DL-薄荷醇、香茅醇、油酸、柠檬酸的校正死亡率最高，均达到了100.00％；而苦豆碱和槐定碱则表现出中等杀线虫活性。

通过图1比较15种化合物处理后24 h与48 h的校正死亡率，可以发现槐定碱、槐胺碱、槐果碱48 h的校正死亡率反而低于其24 h的结果；其原因可能是此3种化合物在处理后24 h对马铃薯茎线虫表现出一定的击倒作用，但线虫并没有被真正杀死，只是暂时被击倒麻痹，经过一段时间后又出现复苏现象。

2．2供试化合物对马铃薯茎线虫的毒力比较

为了进一步对供试化合物进行活性筛选和比较，根据表2的结果选定了dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、柠檬酸、间苯二酚、间苯三酚进行系统毒力测定。根据预试验，将供试化合物配制为5个浓度，则6种化合物对马铃薯茎线虫的毒力结果如表3所示。

由表3的结果不难看出，处理24 h后6种化合物的LC₅₀由小到大的顺序为：香茅醇＜dl-薄荷醇＜柠檬酸＜间苯二酚＜间苯三酚＜油酸；处理48 h后6种化合物的LC₅₀由小到大的顺序为：dl-薄荷醇＜柠檬酸＜间苯三酚＜香茅醇＜间苯二酚＜油酸。

3讨论

本文测定的4类15种植物源化合物多数已经被报道具有杀线虫活性，其中香茅醇和dl-薄荷醇对根结线虫具有较好的活性，且从本试验结果看，它们对马铃薯茎线虫也表现出较高的毒杀活性。对本试验中采用的邻苯二酚、对苯二酚及间苯三酚，文献仅报道可以抑制肾形小盘旋线虫(Rotylenchulusreniformis)对番茄的侵染，而苦豆碱、苦参碱、槐胺碱及野靛碱可以杀死松材线虫，本试验结果丰富了前人的研究内容，证明了上述化合物同样对马铃薯茎线虫具有一定的毒杀活性。另外，有报道用毒扁豆碱1 000 μg／mL可以可逆性地抑制起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)的运动，但本试验结果表明其对马铃薯茎线虫基本无效。有机酸类化合物柠檬酸和油酸对马铃薯茎线虫也具有较好的活性，这个结果提示，在杀线虫剂选择性开发中是应该予以考虑的。

对本试验中所得到的6种化合物的毒力方程进一步分析，可以看出毒力较好的香茅醇和dl-薄荷醇的6值有一定的差异，其中b值较低的dl-薄荷醇相比香茅醇而言可能就具有较高的抗药性风险，而明确这一点对于该类化合物的更进一步认识具有深层次的意义。

植物源杀线虫剂来源于自然界，具有很好的环境相容性，因而是环境友好杀线虫剂研究开发的重要途径；自然界具有丰富的植物资源，应该深入开展杀线虫植物资源的调查，有效地从备选植物中分离、提纯杀线虫化合物并鉴定其化学结构；同时，对已经报道的高活性植物源杀线虫化合物进行活性一结构相关性研究，明确其作用机理，开展仿生合成，应成为开发高效、环保型的杀线虫剂的重要思路。