烟草赤星病菌菌种保存及致病性研究

易　龙

摘要：在烟草赤星病抗性鉴定和生防菌剂筛选工作中，常因菌种在室内连续多代移植培养导致菌株的致病力衰弱，而影响测定结果的准确性和一致性。对此，本研究尝试将赤星病菌种经Richards培养液制备成菌层，置于4℃低温环境条件下长期保存，连续5年测定其培养性状和致病力，与连续转代培养方法保存的菌种进行比较，结果表明在连续5年的试验过程中，Richards法保存的菌种在培养性状和致病性上没有发生衰退，该菌种保存方法制作简单、经济、可靠，适用于烟草品种抗赤星病鉴定和生防菌剂的筛选工作。

关键词：烟草赤星病菌；菌种保存；致病性

中图分类号：S 435．72

烟草赤星病是烟叶成熟后期重要的叶部真菌性病害，是烟草生产上威胁最大的病害之一。该病具有潜育期短、流行速度快的特点，在环境条件适宜的情况下，短时间内即可造成大流行，给烟叶生产带来巨大损失。自1892年首次报道烟草赤星病以来，曾几次给世界烟叶生产带来巨大的经济损失。我国1916年首次在北京附近发现，1964年山东烟区大流行，损失很大，随后此病在全国各烟区日趋严重。1989-1991年，河南省平均每年因赤星病造成烟草损失达2 300万元，成为毁灭性的病害。2000年8月美国康涅狄格州和马塞诸塞州，烟草赤星病大暴发，两州烟草减产75％和89％。目前对赤星病主要靠化学药剂进行治理，随之带来的农药残留、病原菌抗药性以及影响卷烟卫生等问题，限制了农药的大规模应用。生产实践证明，选育种植抗病品种和筛选生防菌剂是控制赤星病经济、安全、有效的途径。

鉴定烟草品种对赤星病抗性以及筛选菌剂都应选择可用于人工接种的代表性菌株。由于烟草赤星病菌菌株问的致病力存在分化现象，故在对烟草赤星病进行试验中，一般选用致病性较强，且稳定一致的病原菌，常规菌种保存方法——连续转代培养，因频繁继代培养，常导致菌株致病力逐渐衰弱，而直接影响抗病性鉴定结果和生防菌剂筛选的准确性与一致性。

本试验旨在通过由Richards法制备在低温条件下保存的烟草赤星病菌菌层，对其培养性状和致病力进行观察和测定，寻求一种简单、经济、可靠的赤星病菌种制作保存方法，有利于烟草赤星病抗病育种和生防菌剂筛选工作的有效开展。

1材料和方法

1．1供试材料

1．1．1供试菌株

烟草赤星病菌菌株Tbs3于2001年在重庆烟区采集的典型病斑上单孢分离获得，经鉴定具有较强致病力。

1．1．2供试烟草品种

烤烟品种K326，种子由云南省烟草科学研究所提供，幼苗在温室培育至15～16片真叶。

1．2试验方法

1．2．1赤星病菌种制作

用1％硝酸钾、0.5％磷酸二氢钾、0.25％硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、5％蔗糖、0.02‰氯化铁组成的Richards培养液进行赤星病菌的静置培养，10 d后培养观察性状，用无菌水洗净附着在菌层上的营养物质后平摊在滤纸上，无菌条件下放置24 h，阴凉保存。

1．2．2赤星病菌菌株培养性状观察

2002-2006每年10月份，将上述保存的菌种(命名为Tbs3-R)同常规每隔3个月连续转代保存于PDA斜面上的菌种(命名为Tbs3-c)转接于PDA平板上，置于26℃恒温培养，将菌种活化后分别挑取直径5 mm大小的菌块转到PDA平板中央，置于26℃恒温箱中培养，于3、5、7 d后测量菌落的增长直径，每菌株设5个重复，每重复为一皿。待皿内菌丝长满以后，观察菌丝的色泽变化。同时取赤星病菌孢子用无菌水配制为2.5×10⁵个／mL孢子悬浮液，26℃培养，6、12、24 h后镜检其孢子的萌发，以芽管长度超过分生孢子小端直径1／2时记录为萌发，每处理重复3次，计算孢子萌发率。

1．2．3两种方法保存菌株的致病力比较

将两种方法保存的菌株Tbs3-R、Tbs3-C进一步在温室盆栽条件下测定对烟草的致病性，将各菌株培养7 d后，用1％无菌葡萄糖溶液配制成2.5×10⁵个／mL孢子悬浮液，每菌株重复3次，每重复处理5株幼苗，每株接种第4～6片真叶，每叶接种12滴，每滴25 μL，接种后26℃保湿培养5 d，以无菌水处理为对照。

统计各菌株的叶片接种位点发病率、发病严重度和病情指数，结果用SPSS12.0软件进行统计分析。发病严重度分级标准及病菌致病力强弱分化标准见表1。

2结果与分析

2．1赤星病菌种制作结果

菌种经静置培养10 d后在液体表面形成茶色或棕色菌层，用无菌水洗净附着在菌层上的营养物后平摊在滤纸上放置24 h，可形成许多暗绿色的分生孢子，于4℃条件下阴凉保存。

2．2两种方法保存菌种的孢子萌发和菌落生长

两种方法保存的菌种孢子萌发率及菌丝生长率见表2。从2001年通过单孢分离获得的赤星病菌菌种连续转代培养的菌株Tbs3-C，以及由Richards法培养的菌层低温保存的菌种Tbs3-R，经连续5年的检测发现，Tbs3-C同Tbs3-R相比，菌种在保存两年后孢子萌发率有显著降低，同时菌丝生长缓慢，菌落多呈不规则形、色泽不均，而Richards法制作的菌层保存的菌种Tbs3-R并无明显变化，孢子萌发和菌丝生长正常，菌落呈近圆形、墨绿色。

2．3两种保存方法菌种的致病力比较

试验结果表明，在连续5年的致病力测定中，转代培养的菌种Tbs3-C致病力变化最为明显，在保存时间两年内(2002、2003年)的检测中，致病力变化不大，菌株致病力仍然较强，而在保存3～4年(2004、2005年)的菌株接种位点发病率逐渐降低，致病力已发生明显的衰退，与前期菌种在致病力上已存在明显的差异，连续保存至第五年(2006年)，菌株致病力急剧衰弱，而Richards法菌层保存的菌种Tbs3 R在致病力等方面无明显变化，结果见表3。

从上述结果可以看出，菌层保存的菌种未经任何转代，一直保存于4℃低温条件下，每次试验取少量菌种活化进行试验，在连续5年(5次)的测试过程中，Richards法保存的菌种Tbs3-R比常规PDA斜面连续转代保存的菌种Tbs3-C致病力强，导致Tbs3-C生长势及孢子萌发率降低原因可能在PDA试管保存过程中经过连续转代后，其生长等方面衰变，同时致病力降低。

3讨论

通过对Richards和常规菌种连续转代培养两种方法保存的菌株培养性状和致病力测定表明：由Richards法保存的烟草赤星病菌菌种Tbs3-R在4℃条件下能够长时间保存，其致病力没有发生衰退。这种制作保存方法较之常用的PDA斜面试管保存法更为经济简单、省事省时，不需要特殊设备，只要把液体培养过程中得到的菌层晾干，放在阴凉处，即可长期保存，又可按试验要求随时制取具有强病原性的新鲜孢子，可为烟草赤星病鉴定选择提供致病力稳定的菌株，从而保证年际间抗性鉴定结果的可比性、一致性和可靠性。

由常规连续转代培养的菌种Tbs3-C在室内培养过程中，菌丝生长发育、孢子萌发率较Tbs3-R缓慢，室内接种叶片致病力有所减弱，在PDA试管保存过程中，经多次转管后容易发生变异，同时菌丝生长易于老化，产毒素能力降低，可能是造成致病力降低的原因之一，该菌株其他生理生化变异需进一步深入研究。

烟草赤星病菌是一类弱寄生菌，为烟草成熟后期重要病原真菌，而新叶对其几乎是免疫的，所以寄主品种的抗病性鉴定和室内生防菌剂的筛选都应采用致病力较强的菌株，本试验还检测出烟草赤星病菌在常规PDA斜面上的保存时间大概为两年左右，超过上述期限，菌株的致病力将明显衰退，而Richards法可为实际应用提供至少在5年内致病力保存方法能否推广应用到其他真菌的保存以及用此种方法可以保存的最长年限，尚待进一步研究证实。