烟蚜茧蜂畸形细胞发生及发育

刘金文　李建平　丛　　斌　李茂海　杨桂华　侯云龙　曲文莉

摘要：烟蚜茧蜂(Aphidius gifuensis)畸形细胞来源于卵的浆膜层。蜂产卵33～36 h后幼虫孵化，每胚胎平均释放150个细胞。畸形细胞的直径随寄生日龄而增加，由初始直径(22.1±6.5)pm增长到第5天达最大为(30.1±8.5)μm。但是，其大小受多种因素影响，随寄主龄期和外界因素等不同而有差异，即使是条件相同其大小也有不同，最小的9.0 pm，最大可达100.0μm，但其数目却随日龄增长而下降。扫描电镜显示：畸形细胞表面覆有微绒毛，4日龄比1日龄的更长、更密，表明吸收和分泌功能增强。

关键词：烟蚜茧蜂；畸形细胞；发生；发育；超微结构

中图分类号：S 476．3

烟蚜茧蜂(Aphidius gifuensis)是寄生蔬菜、果树、棉花和大田作物上蚜虫的一种寄生蜂。作为一种害虫生物防治的重要因子，在温室以及大田中，烟蚜茧蜂都起到了很重要的作用。同时，畸形细胞对寄生蜂寄生寄主也起到了重要的调控作用。以烟蚜茧蜂和烟蚜作为一对模式体系能够揭示寄生蜂寄生寄主的内部机理，并对指导寄生蜂的人工饲养和利用、害虫综合治理以及探索应用生物高科技控制害虫等方面均具有重要的理论和实践价值。同时，为探索寄生蜂与寄主的协同进化作进一步的研究。

茧蜂科、广腹细蜂科、缘腹卵蜂科的蜂卯孵化时，起胚胎营养作用的浆膜释放到寄主血淋巴中，分散后游离形成畸形细胞。分散的畸形细胞在寄主血腔中发育方式从数量、大小、染色体倍性等变化呈现种的特异性。

本文以烟蚜茧蜂和烟蚜为研究体系，观察了烟蚜茧蜂畸形细胞的发生和发育过程以及结构上的变化，这些研究为今后进一步探讨其生理功能奠定基础。

1材料与方法

1．1寄主植物

从沈阳农业大学国家重点免疫实验室试验田中选择直径6～7 cm的萝卜(Raphanus sativus L.)收藏备用。试验前，将萝卜栽植于塑料(d=14 cm)花盆内，待新叶长至6～7 cm时放置于温度为(25±2)℃，相对湿度为70％～90％，每日光照周期L∥D为14 h∥10 h，光照强度为3 000 lx的人工气候培养箱中继续培养。

1．2供试昆虫

1．2．1烟蚜

烟蚜(Myzus persicae)采自沈阳农业大学植物病毒研究室试验田的烟草上，然后接种到上述栽植的萝卜叶片上，控制每株上的蚜量，连代扩繁保种，以备试验。

1．2．2烟蚜茧蜂

从病毒研究室试验田内采集自然发生的僵蚜，在室内羽化出蜂，经鉴定确认后，按雌雄蜂1：1配对，交配后接种于预先繁殖有200～300头烟蚜的盆栽萝卜植株上，进行扩繁。

1．3烟蚜茧蜂畸形细胞在烟蚜体内的发育

1．3．1畸形细胞测量

取150头3～4龄若蚜，后分别转移150个小型指形管(d=1.0 cm，h=2.5 cm)中，再接入150头交配的雌蜂，观察一次产卵寄生行为发生后，将被寄生的蚜虫全部取出，放到新鲜无蚜萝卜上继续进行喂饲；从被寄生24 h后开始，至幼蜂完成在寄主体内的发育，每隔24 h取下20头蚜虫，经电光源解剖镜(OLYMPUs JM型)，在滴有Ringers生理盐水的载玻片上解剖，对不能及时解剖的蚜虫用FAA液(冰醋酸：甲醛：95％酒精：水分别为1：1：10：7)固定。在每头寄主的血淋巴中随机测量20个畸形细胞的直径，最后取其平均值。并对不同日龄畸形细胞，用倒置相差电光源显微镜(OBH型)拍照。畸形细胞活性由0.1％的中性红吸收检测。

1．3．2畸形细胞计数

在蜂卵孵化前，每隔24 h取出寄主蚜虫20头，在15×解剖镜下，从寄主血淋巴中收集15粒卵，接种到含有TC-100Medium(GIBCO公司)的培养皿中，幼蜂孵化后，将其置于震动台上，低速离心使畸形细胞从卵壳中完全游离出来，在显微镜下计数并计算每粒卵产生的畸形细胞的平均数。然后每隔24 h解剖被寄生的蚜虫，取20头幼蜂先浸于70％乙醇中，接着用蒸馏水冲洗，并将蜂表面水吸干，每头幼蜂放在盛有TC-100 Medium的培养皿中解剖，去除寄主血细胞和其他杂物，用玻璃吸管收集其中的畸形细胞滴入离心管管中，3 000 r／min(TL-18M型)离心10 min，以1 mL PTU-PBS(8％苯基硫脲溶于磷酸盐缓冲液0.067 mol／L PBS，pH7.0)冲洗3次，最终在10 mL PBS(0.067mol／LPBS，pH7.0)中悬浮，每10 mL样品中抽取100 μL，用血细胞计数板观察计数的畸形细胞的数量，取5次重复的均值再扩大100倍，即为总的畸形细胞数。

1．4烟蚜茧蜂幼虫在寄主体内的发育

从蜂卵产到寄主体内24 h后，再每隔24 h解剖蚜虫35头，测量35头幼蜂体长、体宽，根据计算公式V=n／4·LD²／4(V：体积；L：长度；D：宽度)计算卵、蛹、幼虫及幼蜂的体积。

1．5畸形细胞超微形态结构的观察

将按1．3．2中的方法收集并粗提的畸形细胞以2.5％戊二醛固定12 h，经O．1 m01／I．PBS冲洗后，以4％锇酸固定，乙醇梯度脱水，经临界点干燥、喷金后，用扫描电镜(SEM)观察。2结果与分析

2．1烟蚜茧蜂在寄主体内的发育

烟蚜茧蜂雌虫体内发育成熟的卵为卵形或梨形，通常可见分隔(图3)，卵长(75.0±5.0)μm，卵宽(25.0±5.1)μm；蜂卵在通过雌蜂产卵器时受到机械挤压，蜂卵的中部稍稍凸起，一般呈柠檬形或长梭形，初产卵长(80.3±5.0)μm，宽(27.4±2.3)μm，卵期一般数小时至几天；卵在发育过程中体积迅速增大，到幼虫即将孵化时卵长(437.0±26.9)μm，宽(242.3±8.0)μm；当卵孵化后，进入幼虫发育期和蛹期，从1龄幼虫的体长(520.0±62.7)μm，体宽(252.9±9.7)μm迅速增长到4龄幼虫的体长(2 300.2±129.1)μm，体宽(700.3±20.4)μm，此时的发育主要应用卵黄内的营养物质。

2．2畸形细胞的产生

烟蚜茧蜂蜂卵从初产到幼蜂孵化，通过胚胎外透明的浆膜能清晰看到，用蕃红染色呈淡绿色(而蚜虫组织经染色后呈现红色)，通常在卵的前极浆膜先分化成畸形细胞，随后其后极浆膜也形成畸形细胞。当幼蜂即将孵化时，随着胚胎的扭动，可见卵的前后极已有球形的游离状细胞在卯壳内滚动，产卵后33～3 6 h，幼蜂孵化时，卵壳和浆膜层常常从卵的中上部一侧破裂，随幼蜂的脱出，有部分畸形细胞以单个或细胞团的形式释放到寄辛血淋巴中，仍有部分细胞暂时停留在卵壳中，随后才分散

到寄主血腔中。而中间的单层浆膜则继续贴附在初孵的1龄幼蜂体上，孵化后数小时以细胞状从幼蜂体脱落(图4)。本研究与Dahlman等报道的结果相吻合。

2．3畸形细胞的发育

通常情况下，畸形细胞呈球形或椭圆形，释放到寄主血淋巴中的颜色为白色或淡绿色，这与寄主血细胞的淡黄色相区别，随着时间的延长，其体积迅速增加，由初始的直径(22.1±6.5)μm至寄生后第5天达最大为(30.1±8.5)μm(图1)。但是，其大小受着多种因素的影响，随着寄主的龄期和外界因素等不同而有差异，即使是相同条件相同龄期其大小也有不同，最小的畸形细胞直径仅为9 μm，最大可达100 μm；畸形细胞虽然染色体可增加许多倍，但是细胞不进行有丝分裂。当幼蜂完成在寄主体内的发育时，畸形细胞的体积变小。

由图2可以看出，蜂卵孵化时，浆膜释放游离到寄主血淋巴中的畸形细胞的数目每胚胎平均为(150±32)个，随着幼蜂的发育数量呈下降趋势。其原因可能是畸形细胞的退化或寄主卵的胞吐作用或幼蜂的摄取。但Vinson and Lewis报道的寄生蜂体内的畸形细胞的数目保持不变。从这一点来讲，畸形细胞的数日变化还有待进一步的研究。

2．4畸形细胞的超微形态结构

在电光源显微镜(OBH型)下就能见到刚刚释放的畸形细胞，大小与寄主血细胞相近，一般球形或椭圆形，呈亮白色(图4)。通过扫描电镜SEM观察，1日龄畸形细胞的细胞核圆形或卵圆形，占据整个细胞的大部分体积，细胞质内细胞器数量较少，细胞表面微绒毛短小且稀疏，脂滴和蛋白质含量较少。当畸形细胞发育成熟达4日龄时，细胞核变大，细胞质内细胞器数量增多，微绒毛较1日龄浓密并且更长，脂滴和蛋白质含量也随之增多，这表明畸形细胞代谢活动旺盛，吸收寄主营养和分泌蛋白质的能力较1日龄增强(图5)。由于试验条件限制，本研究没有观察到Buron和Beckage报道的细胞质内出现空腔，细胞衰老的情况。

3讨论

现有资料表明，畸形细胞均来源于浆膜。寄生蜂蜂卵孵化时，浆膜分离成单个的或小的细胞团，随蜂卵孵化释放到寄主血淋巴中成为独立分散的畸形细胞。本文研究表明畸形细胞由单层浆膜发育而成，这与秦启联研究的中红侧沟茧蜂(Microplitismediator)的畸形细胞的来源相一致。

因浆膜层中间部分退化后形成了畸形细胞，因此造成每胚胎释放细胞的数量随个体发育的不同而有差异，卵在体外培养所释放的畸形细胞明显少于烟蚜茧蜂在自然状态下寄生所释放的数量，并认为在自然状态下寄生的烟蚜茧蜂所释放的畸形细胞数量要多于温室内培养的烟蚜茧蜂的。并且，自然寄生和体外培养释放的畸形细胞的直径要明显大于温室内的。从而表明，寄主的营养及生理条件影响畸形细胞的产生及随后发育。

畸形细胞发育过程中，各种类型溶酶体和分泌酶的出现也说明了细胞内部正经历着蛋白质的分解代谢。当幼蜂即将完成在寄主体内的发育时，畸形细胞的体积变小，这表明细胞正经历内部的解体或向寄主中释放了贮存的蛋白质。

畸形细胞的数量在寄主体内发育呈下降趋势或完全消失。本研究认为畸形细胞数量下降或与幼蜂直接取食作用或与畸形细胞自身的变形、解体有关。但是至于畸形细胞，只是寄生蜂一般性的食物，还是具有其他特殊的生理方面的意义，这个问题还有待深入的研究。随着幼蜂发育成熟，寄主血淋巴中生理条件的恶化，畸形细胞的活性下降。在解剖镜下畸形细胞由明亮透明而转变为污白色，因而认为畸形细胞自身的瓦解是造成其数量下降的主要原因。本研究还表明，当畸形细胞发育体积达到最大时，正是幼蜂进入2龄，取食寄主血淋巴，进人生长和发育的快速增长期，这暗示了畸形细胞和幼蜂发育的同步性。