甲霜灵和生防菌Ｂ７０２对辣椒疫病联合作用机制研究

刘合昌　牛赡光　李忠海　张淑静　李　光

摘要：辣椒疫病是辣椒上的重要病害，由于辣椒疫病病原菌抗药性日益严重，给我国辣椒生产造成极大影响，尤其是在辣椒老产区，该病影响造成减产30-50％，甚至绝产。本文就化学杀菌剂甲霜灵与生防菌B702混剂对辣椒疫病作用机制进行了研究，结果表明，甲霜灵和生防菌B702混剂对辣椒疫病的防治效果明显优于单剂，证明甲霜灵和生防菌B702确实有协同防治作用。为化学杀菌剂防治与生物农药相结合防治病害提供理论参考依据。

关键词：甲霜灵与生防菌B702；辣椒疫病；作用机制；研究

我国是辣椒生产大国，无论是鲜椒还是干椒，产量都位于世界前列。但近年来，由于辣椒疫病病原菌抗药性日益严重，给我国辣椒生产造成极大影响，尤其是在我国辣椒老产区，因该病影响导致减产30-50％，甚至绝产。Katan等提出用化学药物弱化病原菌后有利于生防菌的进攻，并以此作为综合防治的一个重要方法。由于单纯使用化学农药防治辣椒疫效病果很不理想，林相璀等便将化学杀菌剂与生防菌混合使用取得满意效果，为了借鉴该方法防治其它植物病害，我们自对化学杀菌剂和生防微生物对感病植株的作用机理进行了探讨，现报告如下。

1、材料与方法

1.1防治辣椒疫病药效试验

1.1.1供试材料：病原菌为辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici Leonian)SG-7，自寿光辣椒产区土壤中分离。芽孢杆菌B702，本所筛选菌株，菌剂由山东泰诺药业有限公司生产并提供。辣椒品种为“益都红”，由山东省蔬菜研究所提供。

1.1.2供试药剂：辣椒疫病生防菌剂：芽孢杆菌8702可湿性粉剂。化学杀菌剂：25％甲霜灵(Methomyl，Met)。混剂：生防菌剂加甲霜灵。生防菌剂为50亿/g，细度为150—200目，主要添加剂为硅藻土和20％的变形淀粉。当与化学杀菌剂混合制成混剂时，用量减半，另一半以25％的甲霜灵代替。剂型均为可湿性粉剂。

1.1.3培养基(PDA)：去皮马铃薯200g煮沸10min，去渣滤液加入葡萄糖5g，琼脂17-20g，加水至1000mL，pH为6.5；使用前每100mL培养基加10000单位氯霉素5mL，防止细菌污染。

1.1.4灭菌土：将取自济南市郊仲宫镇常年辣椒种植地土壤，一部分在160℃下干热灭菌2h，另一部分不灭菌。

1.1.5菌土准备：将辣椒疫霉病菌(SG-7)接种于灭菌的PDA中，28℃左右培养3—4天，然后取出掺于土中，掺量为土重的2％，再浇水至相对湿度70％-80％即可播种。

1.1.6处理：试验设Met+SG-7、B702+SG-7，Met+B702+SG-7、SG-7和不添加任何菌株或药物(Health)，共5个处理。

1.1.7处理方法：苗期：先将辣椒种用45℃水浸泡20min，然后在常温下继续浸泡24h，捞出并沥去多余水分，28℃左右催芽。当种子露白时按种子量的2％用上述药剂拌种，稍加晾干后播于盆中，每盆25粒。重复4次，对照为变形淀粉和硅藻土拌种。

1.2菌药混剂防治辣椒黄萎病机制

1.2.1紫外吸收法测定各处理辣椒可溶性蛋白质含量参见周顺伍(1989)方法，可溶性蛋白质浓度可利用待测溶液在280nm和260nm波长处吸收值的差计算。

蛋白质浓度(mg/m1)=1.45OD₂₈₀-0.74OD₂₆₀

1.2.2过氧化物酶活性测定原理：根据Kochba方法(1977)，植物过氧化物酶在H₂O₂存在下，能使愈创木酚生成茶色物质，该物质在470nm波长处有最大吸收峰，此峰具有稳定的特征值，所以用来进行定性或定量测定。

过氧化物酶的提取：配制缓冲液，0.05MolTris-HC1(pH7.4)然后在0℃预冷48h；各处理的辣椒叶片各取2.000g，加人预冷的上述缓冲液4ml，在冰浴条件下用研钵研磨匀浆，再用14000r/min离心机离心10min，上清液即为过氧化物酶提取液。

过氧化物酶活性分析：根据Kochba方法(1977)，以每分钟光密度变化值表示酶的活性大小。单位以△OD47⁰/min.μg.protein表示。

1.2.3 SOD酶活性比较酶液的提取：分别取六个处理的辣椒叶片2.000g，加入预冷(0℃)的50mMol/L的磷酸缓冲液(KH2P04-NaOH pH7.8)2ml，缓冲液内含0.1MolEDTA和1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。在冰浴中用研钵研磨匀浆。然后用高速离心机以14000r/min离心10min，上清液即为SOD酶提取液。

酶活性分析：根据邵从本[3]、StewartandR C，BewtyJ D方法。

配制反应混合液(3ml)：50mMol磷酸缓冲液(KH2P04-NaOH pH7.8)，13mMol甲硫氨酸，75uMolNBT，100nMol EDTA，2uMol核黄素(VB，)。有酶液加样时，应先加入60ul酶液(不加酶液应加入60ul水)，最后再加入核黄素。摇匀后，先在28℃的恒温光化反应箱中保温10min，再用光(2×20W荧光灯，光强为4000lux，高度30cm，反应室用锡箔纸衬里)照射15min停止。拿到752型紫外光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂制造)以各处理的没有照光的反应混合液(含酶液)为参比，在560nm测各处理光照后的消光值，另测没有加酶液的混合液消光值。

SOD酶活性计算：根据Giannopolitis等(1977)结果，在15min内SOD酶液的吸光值以5min增加0.100吸光值单位(0.1000D560/5min)，且成线性关系，因此SOD的活性计算时的测定值也以15min为好。根据Beauchamp和Fridovich(1971)将抑制50％NBT所需的酶量定为1个SOD活性单位(unit)。由反应被SOD抑制的百分率来计算SOD的酶量。根据Asada等建立的方程式，则SOD活性可表示为：[SOD](U/mg.protein)=(V-V)/v/C/m V：没有SOD时混合液的反应速率，v：有SOD时混合液的反应速率；C：每毫升SOD提取液中蛋白质含量(mg)；m：反应混合液加入的酶提取液的量(mg/ml)

2、结果分析

2.1室内药剂及生防菌对辣椒疫病的防治效果盆栽试验结果表明(表1)，甲霜灵和生防菌B702的防治效果相当，但两者都明显低于两者混合制剂对辣椒疫病的防治效果，说明甲霜灵和生防菌B702确实有协同防治作用。

2.2化学药物和生防菌对辣椒抗逆性生理的影响

2.2.1 B702与化学药物对辣椒抗过氧化系统的作用

2.2.1.1甲霜灵等对辣椒过氧化物酶的影响

植物叶片中过氧化物酶(peroxidase)是植物中普遍存在的酶类，主要有抗坏血酸过氧化物酶、cyt C过氧化物酶、NADH过氧化物酶、非专一性过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转硫酶等(Salin，1988)。其中非专—性过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶存在于大多数植物中。该酶系主要生理功能是清除H₂O₂和R(HO)₂，以减轻这些物质对机体的损害(Salin，1988，方允中等，1989)。

2.2.2.2过氧化物酶酶活性分析

从表2中可以明显地看出，5个处理的差异非常显著，健康植株的反应速率都比病株4号的高。用甲霜灵处理的两个样本1号和3号酶的活力最高，其酶活速率依次为71.48△POD/min.mg.protein和54.83 APOD/min.mg.protein，分别是4号的5.73倍和4.39倍。而且还可以看出，B702对过氧化物酶的增加没有明显作用，因为其反应速率比健康的还要低，但可以说明一点，过氧化物酶对减轻病害是有作用的，这可以从4号纯SG-7处理的病株结果中得出结论，其反应速率最低仅为L2.48 △ POD/min.mg.protein。另一值得注意的问题是，健康的植株含可溶性蛋白质比病株低，而病株可溶性蛋白质含量则高达1001.45mg/mL。

2.2.3 B702等对辣椒超氧化物歧化酶的影响

2.2.3.1超氧化物歧化酶活性分析

从表中不难发现，不同处理间超氧化物歧化酶活性与过氧化物酶的表现是不一样的。甲霜灵对SOD活性没有诱导作用。甲霜灵处理的植株其活性反应速率与病株差异不显著。而B702SOD的活性最强，为359.63。5号最弱，仅为191.82。从1、2、3号的活性数值可以看出，SOD的活性似乎与病害防治无关，但仔细分析就会发现，SOD活性与植株是否为病株有很大关系。首先，健康植株5号的SOD活性最低，而接种过SG-7经过防治的健康植株和病株SOD活性都明显高于处理5。这说明病害能够诱导SOD活性增强，而其它非致病菌也可以诱导SOD活性增加，而B702不仅不是致病菌而且还是生防细菌，其对诱导SOD酶的活性增加有着双重的意义。

3、讨论

无论是化学杀菌剂，还是微生物活体杀菌剂，不仅能够直接杀死或抑制病原菌，同时对植物的生理也有不同程度影响，说明药物作用机制的复杂性。许多研究都表明，过氧化物酶(peroxidase，简称POD)和超氧化物歧化酶(summxide dismutase，简称SOD)等是组成防御植物细胞机能受破坏的主要酶系统。该酶系统与非酶类植物内源物质Vc和Ve等共同起作用来维持生物活性氧的代谢，提高植物的抗逆性。(Halliwell，1987；Wise，1987l Larson，1988)。朱荷琴等(1994)认为，SOD和POD与棉花对黄萎病抗性密切相关。并发现，棉花受病菌危害胁迫而未感病时，感病品种的SOD和POD酶活比耐病品种提高，可溶性蛋白质比耐病品种低。通过了解化学杀菌剂和生防微生物对感病植株的抗氧化系统的影响，对解决目前的生产实际问题是极有意义的，同时也为用化学农药结合生物防治其它植物病害提供了理论参考依据。

作者单位：山东省滨州市农业局山东省林科院生物药物研究所山东省农科院蔬菜所