木霉菌ＲＥＭＩ转化体对番茄灰霉病的防治及其机理的研究

刘　限　郭培磊　高增贵　赵　岩

摘要：研究不同木霉菌转化体对番茄灰霉病防治效果及机理，为木霉菌生物防治的合理利用奠定基础。利用限制性内切酶介导基因整合技术(restriction enzyme mediated integration，REMI)，通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea)效果优于出发菌T21菌株(出发菌)的3个木霉菌转化体Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55，对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16.9％和8％。木霉菌转化体的产孢能力、分生孢子的萌发率、对碳氮源的利用能力及对高温的抵抗能力都有所提高；木霉菌转化体本身产生的几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性均比出发菌高，因此通过REMI技术可以获得新的有益木霉菌转化体，在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平。说明REMI技术可以用于改良生防木霉菌株的功能，提高生物防治效果。

关键词：限制性内切酶介导整合技术；木霉菌转化体；番茄灰霉病；生防机理

中图分类号：S 482．2．92，S 436．412．13

保护地的高湿、适温条件为番茄灰霉病(Botry-tis cinerea Pers.ex Tris.)的发生创造了适宜的环境，因而该病害成为国内外工厂化高效农业番茄生产中的主要障碍。由于目前生产上仍缺少抗病品种，多数农艺性状优良的品种对灰霉病高度感病，且灰霉病菌已对多种化学杀菌剂(多菌灵等)产生了明显的抗药性，严重制约了番茄的安全生产。因此构建对保护地蔬菜各种逆境均具有明显抗性，同时又能提高对番茄灰霉病抗性的工程菌株具有重要意义，也是今后木霉菌能否成为蔬菜叶部病害无公害防治有效手段的关键。本文以生物防治番茄灰霉病菌的木霉菌(Trichoderma sp.)T21菌株为对象，探索利用REMI技术改良的生物防治菌株对番茄灰霉病的防治效果及可能的生防机理，为我国生物农药工程菌株创建提供新技术，为番茄灰霉病的生物防治提供高效菌株。

1材料与方法

1.1材料

番茄品种为L402。

供试木霉菌为野生菌株T21和转化体Ttrm31、Ttrm34、Ttrm55。灰霉病菌由沈阳农业大学植物免疫室生物工程中心保存。

1.2方法

1.2.1活体植株防病效果测定

选择发育齐一的番茄植株，接种前浇足水。选择3株离体条件下抑病效果较好的木霉菌转化体(Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55)，采用孢子悬浮液喷雾的方法接种。每处理10株，30株喷孢子悬浮液150 mL，然后采用随机摆放的方法将3个处理摆放于人工气候室中，用补湿器补湿，将湿度保持在90％以上，24 h后接种灰霉病菌，7 d后调查发病情况。

1.2.2木霉菌转化体的孢子萌发

将5％葡萄糖的琼脂平铺在无菌的载玻片上，凝固后将调整到一定浓度(10³个／mL)的孢子悬浮液滴加到琼脂上，在无菌的条件下吹干后，将载玻片放在含有水分的滤纸上，于培养皿中25℃下培养12～15 h后，在显微镜下调查孢子的萌发情况。

1.2.3木霉菌转化体的产孢能力

将含有木霉菌孢子的菌片转移到PDA培养基的中央，在28℃下培养7 d后，用10 mL无菌水将孢子洗至试管中，充分振荡使孢子分散均匀，然后用血球计数板计数孢子的数量，从而计算孢子悬浮液的浓度，确定不同转化体的产孢能力。

1.2.4木霉菌转化体对碳氮源的利用能力

以葡萄糖20 g，天冬氨酸2 g，KH₂PO₄1 g，Mg-SO₄·4H₂O 0.05 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，MnSO₄·4H₂O 3.2 mg，ZnSO₄·7H₂O 1.8 mg，琼脂20 g，水1 000 mk，分别用等量的蛋白胨、硝酸钠和尿素代替天冬氨酸，制成不同氮源的培养基。将转化体的菌片转移到培养皿的中央，于28℃下培养，48 h测量菌落半径。

以葡萄糖20 g，天冬氨酸2 g，KH₂PO₄1 g，Mg-SO₄·4H₂O 0.05 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，MnSO₄·4H₂O 3.2 mg，ZnSO₄·7H₂0 1.8 mg，琼脂20 g，水1 000 mL，分别用等量的蔗糖、淀粉、麦芽糖代替葡萄糖，制成不同碳源的培养基。将转化体的菌片转移到培养皿的中央，于28℃下培养，每隔48 h测量菌落半径。

1.2.5高温对转化体生长的影响

将培养3～4 d的转化体和T21木霉菌菌片放置到PDA培养基上，在50℃条件下放置1～2 h，然后再转移到正常温度(25℃)下培养，30～40 h后测量菌落半径。

1.2.6木霉菌转化体几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的测定

几丁质酶的测定参照顾向阳、陈捷等方法，略加改进。β-1，3-葡聚糖酶活测定参照杜良成的方法，以葡聚糖为底物，根据从葡聚糖中释放出葡萄糖的量来测定酶活性。

2结果与分析

2.1木霉菌转化体对番茄灰霉病防治效果

采用限制性内切酶介导整合(REMI)技术，获得木霉菌转化体并应用于番茄灰霉病防治，通过对峙培养和离体叶片试验筛选出3株对灰霉病菌生防效果好的木霉菌转化体菌株Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55。然后将此3株菌株在整株番茄上进行了对番茄灰霉病的防治试验。结果表明，所有番茄均已发病，发病率都达到了35％以上。转化体菌株Ttrm31、TtRm34和Ttrm55的发病率明显低于野生菌株T21和对照。发病率最低的为转化体菌株Ttrm34，发病率为36.9％。所有木霉菌转化体对番茄灰霉病的防效比野生菌株T21的防效都有所提高，其中转化体菌株Ttrm31对番茄灰霉病的防效是最好的，其病情指数为41.1，但是该菌株和菌株Ttrm34和Ttrm55的防效差异不明显，菌株Ttrm34和Ttrm55的病情指数均为42.5；而野生菌株T21的病情指数为50.4；对照的病情指数为593。从中可以看出，木霉菌转化体对番茄灰霉病的防效有了明显的提高(图1)。

2.2木霉菌转化体生防活性机理的研究

2.2.1不同木霉菌转化体的产孢情况

由图2看出，不同转化体产孢能力的差异达到

了极显著水平。Ttrm34产孢能力最高，极显著高于野生菌株T21，而转化体Ttrm31和Ttrm55的产孢能力基本上与野生菌株T21一致，都达到了10⁹个／mL。说明REMI技术插入的位点不同，从而影响了转化体的产孢能力。

2.2.2木霉菌转化体分生孢子的萌发

由图3看出，不同转化体的分生孢子萌发率有极显著(P=0.01)的差异，相对于野生菌株T21，转化体的孢子萌发率发生了很大变化，其中Ttrm31分生孢子的萌发率最高，达到了94％，显著高于T21；而Ttrm55和Ttrm34的分生孢子的萌发率分别为91％和90％，与野生菌株T21(90％)基本一致。

2.2.3木霉菌转化体对碳氮源的利用能力

由图4可以看出，木霉菌转化体对不同氮源的利用能力不同。Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55可以很好地利用各种氮源，在尿素为氮源的培养基上12 h时就可以生长，而野生菌株T21菌株则不能生长；在硝酸钠、蛋白质和天冬氨酸为氮源的培养基上Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55的生长速度大于野生菌株T21。另外木霉菌利用有机氮源的能力较强，而对无机氮源的利用能力较弱。总体来说，转化体对各种氮源的利用能力好于野生菌株T21，说明RE-MI插入引起了转化体对氮源利用的差异。不同木霉菌菌株对碳源的利用能力也不同，在各种糖类为碳源的培养基上，3株木霉菌转化体的生长速度都快于野生菌株T21，说明Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55能够充分利用各种碳源，生长速度快，说明REMI插入引起了转化体对碳源的利用能力不同。另外木霉菌对不同碳源的利用能力也不同，能够很好地利用麦芽糖、葡萄糖和蔗糖，而对淀粉的利用能力较弱。

另外从菌丝的稀疏度也可以看出不同菌株对各种营养的利用存在差异(表1)。不同菌株在相同的培养基上菌丝的稀疏度存在差异，如，在葡萄糖作为碳源的情况下，Ttrm55的菌丝比较稀疏，而其他木霉菌转化体和野生菌株的菌丝则正常；在以天冬氨酸为氮源的情况下，个trm55的菌丝比较密，而其他木霉菌转化体和野生菌株的菌丝则相对较稀疏。在其他氮源和碳源的培养基上生长的菌丝也存在菌株间稀疏度不一样的现象。说明不同菌株对各种养分利用能力不同，也间接说明了转化体是由于质粒插入的位点不同造成的，说明了有外源的基因插入。

从转化体在各种不同氮源和碳源培养基上培养性状可以看出，不同转化体对营养物质的利用能力及菌落形态和颜色均不同。

2.2.4木霉菌转化体对高温的耐性变化

试验表明，所有转化体和野生菌株T21在50℃下处理1～2 h后再正常培养，均能保持正常生长，而且50℃下处理1 h，还能促进转化体生长，但在该温度下处理2 h以上，转化体和野生菌株T21的生长、产孢及菌落形态将受到一定的影响。由于45～50℃下处理时间不超过1 h可保证菌株正常生长，因此在夏天或者春天闷棚中应用转化体时不会影响生防活性的发挥(图5)。总之在高温处理不超过2 h的情况下，转化体和野生菌株可以生长，而且转化体在高温处理1 h时，生长速度反而加快了。

2.2.5酶活性的变化

2.2.5.1几丁质酶活性

由图6可以看出，不同转化体产生的几丁质酶的活性不同，其中Ttrm34的活性最高，其次为Ttrm55，野生菌株T21的活性最低。转化体的几丁质酶活性普遍升高，说明由于REMI插入的存在，激活转化体几丁质酶基因，使几丁质酶表达量增加。但是通过F检测，没有达到显著水平上的差异。

2.2.5.2β-1，3-葡聚糖酶活性

由图7可以看出，不同转化体产生的β-1，3-葡聚糖酶的比活性不同，其中Ttrm34的活性最高，其次为Ttrm55，野生菌株T21的活性最低。转化体的β-1，3-葡聚糖酶活性提高，说明转化体中插入了质粒pV2，造成β-1，3-葡聚糖酶基因的激活，但是通过F检测，没有达到显著水平上的差异。同时发现该酶与几丁质酶具有一定相关性。

3讨论

3.1REMI技术可作为创造木霉菌变异获得生物防治新菌株的手段之一

由于限制性内切酶消化片段对染色体的插入是随机的，即可能发生在无意义序列、调控序列或阅读框架内的一个或几个识别位点上，质粒依赖其相容末端插入被切开的基因组中。一旦整合于有意义序列，该序列控制的一系列性状将产生突变。其插入的随机性决定着受影响的表型将是多种多样的。目前REMI技术主要应用于不同植物病原菌致病相关基因的研究中，且有用于创造木霉菌株变异、筛选新生防菌株的报道。本文在优化木霉菌T21菌株原生质制备、再生、转化条件的基础上，利用REMI技术将外源质粒DNA随机插入到木霉菌的染色体中，从而使木霉菌中某些基因激活或者失活，筛选出几株生防机理不同的木霉菌转化体。

3.2REMI技术可改变生物防治菌株的多种机能

研究中发现REMI技术可改变出发菌T21原来的一些生物学特性，如Ttrm34产孢量极显著增加；Ttrm31分生孢子萌发率极显著提高；各突变株利用碳氮源的能力有所提高；菌株对高温的抗性也发生一定的变化，50℃高温处理1 h可促进木霉菌转化子的生长，而出发菌T21在此温度下生长受到了一定的抑制。这些变化对生防活性的提高都有一定的贡献，由此看出木霉菌生防活性不是哪一种机理能达到的，需要从多方面来研究。总之，REMI技术如结合适宜的木霉菌转化体筛选技术，有希望成为获得多种生物防治功能菌株或发现新生物防治机理的方法。

3.3木霉菌优良转化子为生物防治番茄灰霉病提供了新途径

本文从REMI技术构建的木霉菌转化子中筛选出防效明显提高的生防菌株，与出发菌相比转化子对番茄花器和叶片灰霉病的防效平均提高了16.9％和8.0％。由于在温室内灰霉病对花器侵染后会进一步侵染果实，从而影响番茄的产量，因此对花器侵染的控制，必将降低果实灰霉病的发生，对提高田间防效更有意义。筛选的转化子多代繁殖后仍具有稳定的抗潮霉素性能，说明REMI技术构建的转化子在一定条件下能实现不可逆遗传改良。这反映出外源基因片段诱发木霉菌发生有益变异的潜力较大，为今后进一步利用木霉菌插入变异潜力，开发多功能、高效生防因子奠定了新的技术基础。当然在选择过程中需要注意从多方面来综合考虑木霉菌对番茄灰霉病的防治效果，不能只考虑一个方面。另外，根据木霉菌转化体生防机理的不同，可以研究将多种木霉菌转化体混合施用来提高木霉菌对番茄灰霉病的防治效果或许能够改变木霉菌生防制剂活性低和不稳定的问题。