应用尖孢镰刀菌毒素滤液鉴定大豆品种抗病性初探

台莲梅　许艳丽　闫凤云

摘要引起大豆根腐病的尖孢镰刀菌粗毒素不仅能使大豆根部产生类似病菌侵染引起的症状，而且能抑制大豆幼根的生长和对大豆幼苗具有致萎作用；用毒素滤液处理大豆胚根和幼根，测定大豆不同品种抗病性，用盆栽土壤作对照，试验结果基本一致。利用毒素滤液测定不同品种对大豆根腐病的抗病性，可应用于大量的初筛工作。

关键词尖孢镰刀菌；毒素；大豆；抗病性

中图分类号S 432．23

大豆根腐病是大豆的重要病害之一，是一种分布较广、危害较重、防治困难的土传病害。我国大豆根腐病主要分布于黄淮地区的夏大豆和北方春大豆生产区，其中黑龙江省东北部地区发生较重。根腐病使大豆常年减产10％～30％，重病地区可减产60％。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是引起大豆根腐病的主要致病菌，目前对该病的防治主要是通过药剂拌种，防效期一个月左右，而且只能防幼苗时期，防治效果不是十分理想。应用抗病品种控制该病是首选的措施，但常规的抗性鉴定耗时费工，易受环境条件影响。在研究了尖孢镰刀菌产毒条件的基础上，进一步研究用该毒素鉴定大豆品种抗病性，试图探索出一种快速、简便鉴定品种抗性的方法。

1材料与方法

1．1供试菌株

供试菌株从大豆病株上分离，并经柯赫氏法则验证。

1．2供试品种

由黑龙江省农业科学院大豆研究所、绥化所、合江所、东北农业大学大豆研究所、黑龙江八一农垦大学科研所等提供品种。

1．3大豆不同品种抗性鉴定

1．3．1病原菌扩繁

菌株在PSA培养基上25℃培养7d左右，再将病原菌接种到玉米砂培养基上进行扩繁，于25℃培养25d左右，用作接菌。

1．3．2土壤接种

取田间自然土壤经过筛后，用50倍的福尔马林液进行土壤消毒，1 m²浇1 000mL。

将三角瓶的玉米砂培养菌倒出，搅碎混匀，然后和无菌土按质量比4：30的比例充分混合配成菌土。将接好菌的土装人口径15 cm的花盆内，每盆土壤的量保持一致，播种前预先灌水保湿2～3 d，每盆播种10粒大豆种子，每一品种处理3盆。

1．3．3发病调查

在幼苗二出复叶展开时进行病害调查。从土壤中取出苗，将根部冲洗干净，调查病情指数。

病情分级标准为，0：幼苗茎基部和主、须根均无病斑；1：茎基部和主根上有少量病斑；2：茎基及主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的1／4—1／2；3：茎基部及主根上病斑多且较大，病斑面积占茎基部和根总面积的1／2～3／4；4：茎基部或主根上病斑连片，形成绕茎现象，但根系并未死亡；5：根系坏死，地上部萎蔫或死亡。

1．4毒素培养滤液制备及提取

菌株移接在PSA平板培养基上，于25℃下培养7d，沿菌落边缘打出直径为8cm菌片，接人装有100mL培养液的250mL三角瓶内，每瓶接4片，置25～30℃下光照培养15d。培养液经过滤，再高温灭菌20min，滤液保存在4℃冰箱内，供测试用。毒素的提取采用炭吸附法提取。

1．5粗毒素的毒性测定

1．5．1毒素对大豆根部的致病性

挑选大小一致的大豆种子，用漂白粉浸种10min，进行表面消毒。用无菌水清洗3遍后，加水置25℃恒温箱浸泡4—5 h，然后于25℃下催芽，待胚根长4～5cm时，置于加有10mL毒素原液直径为11 cm的培养皿内，皿内底部铺一张滤纸，大豆上盖一张滤纸，在25℃下恒温处理48h，进行症状观察。另外，用菌丝块接种于大豆胚根上，观察发病情况。

1．5．2毒素对大豆胚根生长的影响

采用抑制胚根生长测定法。将供试的大豆种子用清水洗净，用漂白粉溶液(1：14)浸种10 min，进行表面消毒。用无菌水冲洗3遍后加水置25℃恒温箱浸泡4—5 h，然后于25℃下催芽(待芽长2—3 mm为宜)，然后将大豆种子胚芽向下置于加有5mL滤液的培养皿内，皿内铺一张无菌滤纸。以空白培养液处理为对照。25℃黑暗下培养，48 h后测定并计算胚根生长抑制率。每处理30粒种子，3次重复。

胚根生长抑制率＝[(对照胚根生长长度一处理胚根生长长度)／对照胚根生长长度]X100％。

1．5．3毒素对大豆幼苗的致萎性

取一出复叶刚展开的大豆幼苗，根系洗净后切去一小段根，浸入装有毒素溶液的试管中，毒素液内含有少许链霉素，防止细菌污染。

观察萎蔫情况。植株反应级别分为无反应、轻度反应、中度反应和重度反应。其标准是：无反应，植株正常，叶片无萎蔫；轻度反应，真叶下垂或卷曲，复叶正常；中度反应：真叶、复叶卷曲，重度反应：整个叶片卷曲至枯死。

1．6培养滤液对大豆不同品种胚根生长的影响

方法同1．5．2。

1．7培养滤液对大豆不同品种幼根细胞透性的

影响

将大豆种子表面消毒后，浸种4—5 h，摆于铺有无菌滤纸的磁盘内(35cmX25cm)，置于25℃恒温箱内，培养3—4d，取长势一致的幼根用于试验。

采用电导法测定细胞膜透性。

2结果与分析

2．1毒素的毒性测定

2．1．1毒素引起大豆根部的症状

用粗毒素接种后，毒素对大豆生长发育具有抑制作用，经毒素液处理后的大豆根未形成侧根，胚根变褐，坏死，产生的症状与病原菌接种所引发的症状相似。

2．1．2毒素对大豆胚根生长的影响

对毒素的不同浓度进行了测定，当毒素体积分数分别为10％、25％、50％、75％、100％时，胚根抑制率分别为26．3％、49．2％、61．0％、64．2％、75．9％，表明毒素对大豆胚根生长有明显的抑制作用，毒素浓度越高，抑制作用越强，见图1。

2．1．3毒素对大豆幼苗的致萎性

不同的处理对大豆幼苗的致萎作用不同。结果见表1，处理24h，毒素液体积分数为100％和50％使大豆植株的真叶下垂，叶缘轻微卷曲，复叶正常；处理48h后，100％毒素液中大豆真叶、一出复叶都卷曲；72h后，100％毒素液中的植株枯死，50％毒素液中大豆真叶、复叶萎蔫。无菌水及10％毒素液处理植株正常。

2．2培养滤液对大豆不同品种胚根生长的抑制

作用

低浓度培养滤液对大豆不同品种胚根抑制率存在着差异。毒素滤液的体积分数为10％时，对抗病品种的胚根抑制率低于感病品种，抗性品种绥农10对病原菌的抗性强，病指为20．8，对毒素也不敏感，培养滤液对它的胚根生长抑制率为28．8％。反之，感病品种对病原菌严重感病，病情指数高，培养滤液对它的胚根抑制率也高；然而随着滤液体积分数的提高，胚根抑制率相应增高，品种间差异有缩小的趋势。说明抗病品种只能忍耐一定浓度范围的培养滤液毒素(表2)。

2．3培养滤液对大豆不同品种根细胞渗透性的

影响

50％毒素滤液处理不同品种大豆幼根后，根细胞的渗透性有明显的不同。病菌接种后病情指数高的品种，用毒素滤液处理后其电导率较大；病情指数低的品种，毒素滤液处理后其电导率较小。在抗病品种和感病品种之间差异较大时，抗病品种和感病品种根细胞渗透性差异达极显著水平(表3)。

3结论与讨论

许多研究表明，用病原菌的毒素液进行品种的抗病性鉴定是可行的。用毒素进行品种抗病性鉴定具有快速、简便、不受季节限制等特点。大豆根腐病是土传病害，在田间条件下无法进行人工接种，只能靠田间的自然菌量，其鉴定的结果常受土壤条件所影响，用盆栽土壤接种法，如大量筛选抗源，工作量非常大。采用尖孢镰刀菌培养滤液处理大豆胚根测定不同品种的抗性，与盆栽土壤接种法结果基本一致。因此，此方法可用于抗病育种的大量初筛工作中，具有快速、省工等优点。用种子胚根抑制法测定不同品种抗性，要注意一个问题：要选好毒素滤液的浓度，否则误差较大。

刘惕若等用电导法测定小麦品种对赤霉病菌的抗性差异表现十分明显，并提出鉴定小麦品种抗性的细胞膜损伤率的合理级别。本试验应用电导法测定大豆幼根的细胞渗透性大小基本上反映了大豆品种对根腐病的抗性强弱，此法的优点是快速、简便，试验可在短期内重复进行，但它与毒素滤液处理大豆胚根相比，繁琐一些。由于电导法非常灵敏，因此必须严格操作，避免或减少人为误差，提高测定的准确性。

应用毒素进行品种抗病性鉴定，抗性指标的量化还有待于进一步研究。