植物雌激素大豆黄酮对断奶期小鼠乳腺退化的减缓作用研究

黄心河，张亚峰，伍钢，陈雨涛，周潇，张源淑，韩正康

(南京农业大学动物医学院/农业农村部动物生理生化重点开放实验室，江苏 南京 210095)

乳腺是哺乳动物特有的器官，负责乳汁的合成与分泌，良好的发育是乳腺充分发挥泌乳功能的前提，对畜牧业生产及动物子代的生长发育具有重要影响。乳腺发育先后历经胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期5个阶段[1]，其中退化期是乳腺发育过程中的一个重要阶段。缩短乳腺的退化时间，延缓乳腺的退化，延长泌乳期可以发挥出奶牛、奶山羊等乳用动物的最大经济价值，对畜牧业生产提质增效具有重要意义。

乳腺退化始于腺体内的乳汁郁积[2]，乳腺上皮细胞分泌活动停止，细胞体积逐渐减小并开始凋亡，同时腺体重塑恢复至孕前状态[3]。动物机体通过多种内分泌激素和细胞因子对退化期的乳腺凋亡严密调控，维护乳腺的内分泌平衡，确保乳腺周期性的泌乳性能正常[4]。研究表明，雌激素(E)是乳腺重塑和功能调节的重要驱动因子[5]，催乳素(PRL)[6]、生长激素(GH)[7]、胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)[7-8]和肿瘤坏死因子α(TNF-α)[8-9]对乳腺上皮细胞凋亡的调节均具有重要作用。

植物雌激素是天然存在的一类非甾体酚类植物化合物，大豆黄酮(DZ)属于异黄酮类植物雌激素之一，化学结构与17-β-雌二醇(E2)相似，能与雌激素受体(ER)结合，从而表现出雌激素活性和抗雌激素活性[10]。研究表明，DZ可促进乳腺上皮细胞的增殖和乳腺发育[11]，表现出雌激素激动剂的促进作用，与多种激素协同促进乳腺发育及泌乳[12]，同时影响凋亡相关蛋白的表达[13]，显示了DZ在调控乳腺发育方面的开发潜力。DZ对乳腺的发育以及泌乳等方面的影响已有研究，但如何影响乳腺的退化尚未见详细报道。

本试验使用DZ处理妊娠中期小鼠，于断奶的不同时期采样检测，通过测定血清中相关激素和细胞因子含量、观察乳腺的组织学变化及检测凋亡相关蛋白的表达量等，初步探讨DZ对断奶期乳腺退化的影响，为植物雌激素DZ在乳用动物生产中利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 DZ和试剂

DZ由南京农业大学韩正康教授赠送(纯度>98%)；鼠源E2、PRL、IGF-Ⅰ ELISA 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；组织/细胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF及兔β-tubulin抗体均购自南京巴傲得生物科技有限公司；兔Bax和兔Bcl-2抗体购自Cell Signaling Technology公司；羊抗兔IgG购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；PVDF膜购自美国密理博公司；ECL显色液购自翌圣生物科技公司；反转录试剂盒购自艾科瑞公司；TRIzol试剂、qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒购自Vazyme Biotech公司；异丙醇购自上海试四赫维化工有限公司；DEPC水购自南京生兴有限公司等。

1.2 仪器与设备

POWER-PAC 300电泳仪和POWER-PACHC转印仪均购自BIO-RAD公司(美国)；全自动化学发光图像分析仪购自天能公司(中国上海)；RT-qPCR仪(罗氏LightCycler96)；BioPhotometer-D30核酸蛋白测定仪(德国)；酶标仪购自Tecan公司(瑞士)；组织研磨仪购自赛维尔公司(中国武汉)等。

1.3 实验动物

SPF级ICR小鼠，7周龄，雌性48只，雄性24只，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK(浙)2019-0002。饲养于南京农业大学实验动物中心，饲养环境为温度(22±2)℃，相对湿度50%～60%，12 h光照和12 h黑暗条件下，自由饮食和饮水。统一饲喂生长繁殖饲料，饲料配方包括东北玉米、小麦、西班牙苜蓿草、秘鲁鱼粉、美国鸡肉粉、植物油、氨基酸、维生素、矿物质等。饲料由本实验室提供。

1.4 试验分组及处理

适应性饲养1周后，将雌雄小鼠以2∶1的比例混笼饲养，通过观察阴道栓判断雌鼠是否受精，有阴道栓出现的记为怀孕0.5 d。将孕鼠随机分为对照组(CON组)、大豆黄酮组(DZ组)，每组24只。在母鼠怀孕14 d开始，每日下午15：00，DZ组按照每kg体重100 mg的剂量腹腔注射DZ，CON组注射等量的无菌PBS处理，连续7 d。试验期间观察发现小鼠精神状况良好，饮水饮食及活动均正常，怀孕和分娩过程中无异常情况发生，符合试验条件。试验在南京农业大学实验动物中心进行，经南京农业大学实验动物中心动物伦理委员会批准。

1.5 样品采集

孕鼠正常分娩后，于哺乳期第10 天强制断奶。在断奶1、3及7 d这3个时间每组各取8只小鼠，禁食12 h后称重。采集血液后颈椎脱臼处死小鼠，剥离皮肤采集小鼠全部乳腺组织并称重。收集的血液经3 000 r/min 离心15 min，获得血清于-20 ℃保存。取第4对乳腺组织用于4%多聚甲醛固定，剩余乳腺组织置于-80 ℃冻存。

1.6 指标测定

1.6.1 乳腺指数的测定

将小鼠解剖后取出的所有乳腺称重并记录，计算乳腺指数(乳腺湿重/小鼠体重×100%)。

1.6.2 血清E2、PRL及IGF-Ⅰ浓度的测定

用酶联免疫检测试剂盒测定血清中E2、PRL及IGF-Ⅰ浓度，按照试剂盒说明书要求操作测定。

1.6.3 小鼠乳腺组织切片HE染色及乳腺退化情况的量化计算

组织切片由南京农业大学病理组制作。苏木精-伊红(HE)染色：将固定好的乳腺组织脱水、透明，之后石蜡包埋，常规法制作组织切片。光学显微镜下观察乳腺组织的变化。

参照Chapman[14]方法，以脂肪细胞占据的腺体面积以及腺泡所占据的腺体面积作为指标，对发生的乳腺退化情况量化处理。各时期每组分别选取10个100倍放大的视野，利用Image J软件计算每个视野中脂肪细胞的面积以及腺泡的面积，得出两者面积分别占视野总面积的百分比，以直方图形式表示。

1.6.4 荧光定量PCR(RT-qPCR)检测乳腺组织中凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达

TRIzol一步法提取乳腺组织总RNA，测定RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板RT-qPCR检测。使用Primer Premier 5.0软件设计引物序列(表1)，引物由北京擎科生物股份有限公司合成。

表1 RT-qPCR相关基因引物序列

1.6.5 Western blot检测乳腺组织中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达

称取约35 mg的乳腺组织，加入预冷的裂解液RIPA(含PMSF)匀浆后，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液BCA法测定蛋白浓度，统一蛋白浓度为5 μg/μL，加上样缓冲液，100 ℃变性10 min制样。每孔上样50 μg，进行SDS-PAGE，然后湿转法将目的蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h后加入一抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、β-tubulin(1∶10 000)，4 ℃孵育过夜。次日TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的1∶10 000羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h。洗涤后加入ECL发光液，全自动化学发光分析仪中检测，Image J软件分析各条带灰度值。以β-tubulin为内参，比较目的条带相对灰度值。

1.7 数据统计和分析

数据采用IBM SPSS 21.0软件进行方差分析，GraphPad Prism 8.0软件作图，试验结果均以“平均值±标准误”表示，其中P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 DZ处理对断奶期小鼠乳腺指数的影响

结果如图1所示。与CON组相比，断奶1 d时DZ组乳腺指数显著增加(P<0.05)；断奶3 d和7 d时DZ组乳腺指数有所降低，变化不明显。但与断奶1 d相比，断奶3 d和7 d时CON组及DZ处理组乳腺指数均极显著降低(P<0.01)。

注：同一时间点与对照组相比，* 表示差异显著(P<0.05)；与断奶1 d时相比，##表示差异极显著(P<0.01)。下同。

2.2 DZ处理对断奶期小鼠血清中E2、PRL及IGF-Ⅰ浓度的影响

如表2所示，断奶1 d时，与CON组相比，DZ处理降低了母鼠血清中E2浓度，显著提高了血清中PRL(P<0.05)及IGF-Ⅰ浓度(P<0.01)。断奶3 d时，与CON组相比，DZ处理极显著提高了血清中E2(P<0.01)和PRL浓度(P<0.01)，IGF-Ⅰ含量无显著变化。断奶7 d时，与CON组相比，DZ处理提高了血清中E2浓度(P<0.05)，血清中IGF-Ⅰ和PRL浓度无显著变化。

表2 不同断奶期小鼠血清中E2、PRL、IGF-Ⅰ 浓度(n=8)

2.3 断奶期母鼠乳腺组织形态学变化

如图2所示，CON组在断奶1 d时乳腺组织被腺泡充斥，且腺泡结构完整内充满乳汁及其他分泌物。随着断奶时间延长，乳腺组织内腺泡缩小且脂肪组织重新出现，到断奶7 d时乳腺组织已全部被脂肪组织及结缔组织所占据。DZ处理组乳腺组织中变化与CON组较一致，但相比于CON组，DZ组腺泡更大且结构较为完整。断奶3 d时，DZ处理组减少了脂肪细胞的增多，且缓解了腺泡大范围缩小及数量减少的情况；断奶7 d时，相对于CON组乳腺组织被丰富的脂肪组织和结缔组织包围的情况，DZ组还存在极少量完整的导管及腺泡。提示：DZ处理有减缓乳腺退化作用，但在断奶早期阶段效果更优。

图2 DZ处理对乳腺组织形态的影响(HE,比例尺=50 μm)

为了量化已经发生的退化量，测量了脂肪细胞占据的腺体面积，以及腺泡占据的腺体面积。如图3所示，与CON组相比，DZ处理组在断奶1 d、3 d和7 d三个时间点母鼠的腺泡面积比均有所增加，其中断奶3 d时，DZ处理组较CON组差异显著(P<0.05)；同时与CON组相比，DZ处理组乳腺组织中脂肪细胞面积比均显著降低(P<0.05)，且随断奶时间的延长，腺泡比例的下降与脂肪细胞占比增加呈正相关。

图3 DZ对断奶期小鼠乳腺退化的影响

2.4 DZ对断奶期小鼠乳腺组织中Bax和Bcl-2基因表达的影响

与CON组相比，断奶1 d时(图4A)，DZ组极显著下调了凋亡基因Bax(P<0.01)的表达，同时极显著增加了Bcl-2/Bax表达的比值(P<0.01)；断奶3 d时(图4B)，DZ组极显著下调了Bax的表达水平(P<0.01)，同时极显著上调了Bcl-2基因的表达水平(P<0.01)，且DZ处理后极显著增加两者的比值(P<0.01)；断奶7 d时(图4C)，DZ处理后均极显著下调了Bax和Bcl-2基因的表达水平(P<0.01)，DZ组显著增加Bcl-2与Bax表达的比值(P<0.05)。

注：同一指标与对照组比较，*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。下同。

2.5 DZ对断奶期小鼠乳腺组织中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

与CON组相比，断奶1 d时(图5)，DZ组极显著上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.01)，上调了凋亡蛋白Bax的表达水平(P>0.05)，同时极显著增加了Bcl-2/Bax比值(P<0.01)；断奶3 d时(图6)，DZ组极显著降低了Bax的表达水平(P<0.01)，且极显著提高了Bcl-2的表达水平(P<0.01)，同时也极显著增加了Bcl-2/Bax比值(P<0.01)；断奶7 d时(图7)，DZ组极显著极提高了Bax和Bcl-2蛋白的表达水平(P<0.01)。

图5 DZ对断奶1 d小鼠乳腺组织Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响

图6 DZ对断奶3 d小鼠乳腺组织Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响

图7 DZ对断奶7 d小鼠乳腺组织Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响

3 讨论

乳腺组织结构大体可分为具有泌乳功能的实质(腺泡和导管系统)和起支持作用的间质(主要是结缔组织和脂肪组织)[15]。腺泡作为泌乳的基本单位，其数目决定泌乳能力[16]。幼畜断奶后，乳头失去了吮吸刺激，腺泡腔内乳汁无法正常排出，乳腺分泌活动停止同时其结构发生变化，乳腺组织及导管退化并被增殖的结缔组织和脂肪组织所取代[17]。Bennetts等于1946年首次发现大豆异黄酮可以引起空怀山羊的乳头增长，甚至出现泌乳现象，提示异黄酮植物雌激素可以影响乳腺的发育和泌乳。刘春龙等[11]研究发现，一定浓度范围的DZ能促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖。本研究结果显示，随断奶时间延长乳腺腺泡面积比不断下降，脂肪细胞占比不断增加，这与李健等[18]的研究结果一致。与CON组相比，DZ处理后提高了断奶期小鼠乳腺中腺泡的面积比，降低了脂肪组织的面积比；同时乳腺指数结果显示，在断奶1 d时，DZ组的乳腺指数增加，各组乳腺指数随着断奶时间延长乳腺指数不断减小，断奶3 d、7 d时DZ处理降低了母鼠的乳腺指数。提示DZ可能是通过增加腺泡比例，减缓脂肪细胞在乳腺组织中分化增殖的进程，从而影响乳腺的退化过程。

卵巢分泌的雌激素在哺乳动物乳腺生长发育的过程中扮演者重要的角色，它可通过与雌激素ER结合来影响乳腺发育，同时协同其他激素促进腺泡发育及乳汁生成[4]，但大剂量的E2在体内易残留且有毒害作用，会引起发育、生殖、行为等方面的异常变化。DZ是来自大自然的纯天然药物，与E2相比具有不良反应小且安全的优势。研究发现DZ能与ER结合，表现出雌激素和抗雌激素活性[19]。同时本研究结果显示，断奶1 d时DZ组的血清E2含量低于CON组，DZ可能是通过与内源性雌激素竞争ER，占据受体结合部位，发挥抗雌激素作用降低E2含量；而随断奶时间的延长，DZ通过发挥其雌激素样作用使得血清中的E2含量提高，发挥雌激素样作用，从而影响着乳腺的发育情况。PRL是一种由垂体泌乳素合成和分泌的肽激素，IGF-Ⅰ是乳腺生长发育的旁分泌因子之一。乳腺退化过程中受诱导凋亡和抑制增殖双重因素的影响，乳腺上皮细胞数目不断下降[4]。研究发现，PRL可对退化期的细胞死亡进行调控[7]，维持乳腺细胞的数量[1]。韩正康[20]研究发现，异黄酮类植物雌激素可与动物乳腺、垂体、下丘脑的ER竞争性结合，诱发血中PRL水平升高。另有研究证实DZ可通过PRL间接发挥作用[21]。本研究结果显示，DZ处理后提高了断奶期内母鼠血清中的PRL含量，将血清中PRL含量在断奶7 d内维持在较高水平，当再次恢复泌乳时，高水平的PRL利于泌乳同时保持乳腺细胞数量，从而减少细胞凋亡，影响乳腺的退化。IGF-Ⅰ在乳腺退化过程中参与乳腺组织的重建，其作用由胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)来调节。乳腺细胞的生长与凋亡取决于乳腺中IGFBP-5与IGF-Ⅰ之间的相对平衡[22]。IGFBP-5可通过高亲和力与IGF-Ⅰ结合，阻止IGF-Ⅰ与其受体IGF-ⅠR的相互作用，从而抑制IGF-Ⅰ介导的细胞生存，调控乳腺退化[23]。研究发现在妊娠母猪日粮中补充DZ能提高血清IGF-Ⅰ中含量[24]。本研究结果也显示，DZ处理后提高了断奶期内血清IGF-Ⅰ含量。据报道由E2激活的核受体刺激IGF-Ⅰ的局部合成[25]，DZ处理后可能通过提高血清E2浓度，从而上调IGF-Ⅰ的表达，增加IGF-Ⅰ与其受体的亲和力，抑制IGFBP-5表达，提高乳腺上皮细胞的存活率，更好发挥IGF-Ⅰ作为细胞生存因子促进有丝分裂抑制乳腺凋亡的作用，详细机理有待进一步研究。

乳腺的退化分为2个阶段：第一阶段是由乳停滞引发溶酶体介导的细胞死亡，发生在断奶48 h内，导致乳腺上皮细胞发生广泛的程序性细胞死亡，引起上皮细胞数量减少，此阶段乳腺在哺乳刺激下可重新泌乳[2]；第二阶段发生在断奶2～7 d，主要是由线粒体介导的细胞凋亡来进行[3]，引发腺泡塌陷、细胞外基质重塑、脂肪细胞的分化及细胞凋亡[2]。Bcl-2相关蛋白是影响乳腺上皮细胞凋亡的细胞内信号介导者，在调节乳腺退化中发挥关键作用。抗凋亡Bcl-2基因缺乏会加速乳腺细胞凋亡，其过表达可抑制乳腺第二阶段的退化，促凋亡Bax基因缺失会延缓乳腺的退化[26]。Kuma等[13]研究发现，DZ可通过介导细胞凋亡的内在途径影响Bax与Bcl-2蛋白的比值。在细胞内Bcl-2和Bax蛋白之间的相互作用是拮抗性的，细胞凋亡由Bcl-2/Bax比值的变化调节[27]。因此，Bcl-2/Bax比值通常用于检测细胞凋亡效应。本研究结果显示，DZ处理可能通过提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制促凋亡蛋白Bax的表达，增加Bcl-2/Bax的比值，使乳腺抗凋亡的过程处于优势，抑制细胞的凋亡。但在断奶7 d时，DZ抑制凋亡的作用不明显，DZ可能通过抑制细胞的凋亡进程来延缓乳腺的早期退化过程。

综上，本研究显示植物雌激素DZ可通过间接提高断奶母鼠血清中IGF-Ⅰ、PRL含量发挥其促生存作用，上调Bcl-2蛋白的表达，增加Bcl-2/Bax比值，抑制细胞凋亡进程，减少乳腺上皮细胞的凋亡，同时降低脂肪细胞所占面积比，减缓脂肪细胞在乳腺组织中分化增殖的进程，延缓乳腺的早期退化过程。