基于P32蛋白的山羊痘病毒抗体荧光微球检测方法的建立

孟卫芹，王金良*，吴信明，唐娜，李通，石竞楠，董帅，沈志强

(1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2. 青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109；3. 内蒙古民族大学生命科学与食品学院，内蒙古 通辽 028000；4. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056000)

山羊痘是由山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)感染引起的发病急、热性、高度接触性传染病，造成被感染山羊的皮肤、消化道黏膜和呼吸道出现痘疹等症状，是具有严重威胁的一种动物痘病[1]。山羊痘被世界动物卫生组织(WOAH)列为必须通报的动物疫病[2-6]，我国农业农村部将其列为二类传染病。该病广泛分布于世界各地，如非洲、中东、北欧各国等[7]，近几年来，在我国多个地区也有相关报道[8-9]。该病的发病率和死亡率均较高，尤其羔羊感染后的死亡率最高可达100%[10]，给部分地区养羊业带来严重的经济损失。

GTPV基因组为线性双股、两端共价闭合的DNA，长度约为150 kb，编码约150个蛋白[11]。P32蛋白是位于羊痘病毒膜表面的一种结构蛋白，包含1个重要抗原决定簇，能诱导产生良好的中和抗体[12]，可以用于建立血清学诊断技术。目前常用的血清学检测方法有病毒中和试验(VNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、琼脂扩散试验(AGID)和间接免疫荧光(IFA)等[13-14]，这些方法存在费时费力、试验步骤繁琐、特异性和敏感性不高等缺点；PCR技术也可用于检测山羊痘[15]，但需要昂贵的仪器设备和专业人员，不利于在基层推广。荧光微球免疫学检测技术(FMIA)是一种超敏免疫分析方法[16]，具有低背景、强特异性、高灵敏度等优点，已被广泛应用于病毒、细菌、药物、激素等的快速检测分析[17]。

本研究将实验室前期成功构建的pET28a-P32重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达及纯化后得到重组P32蛋白，以镧系元素铕(Eu)及其螯合物作为标记物对重组蛋白进行偶联标记，成功建立了一种快速检测GTPV抗体的荧光微球免疫层析方法，为山羊痘病毒抗体的现场快速检测提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 血清

GTPV阳性血清购自中国兽医药品监察所；GTPV阴性血清，山羊副流感病毒3型(CPIV3)，小反刍兽疫病毒(PPRV)，羊口疮病毒(ORFV)阳性血清和兔抗山羊IgG多抗均由本实验室保存；120份临床血清样品为内蒙古、山东等地羊场送检保存。

1.2 主要试剂和耗材

原核表达重组质粒pET28a-P32由山东省滨州预防兽医学与动物生物技术重点实验室保存，截取了P32蛋白抗原表位集中的N端2 ～ 141 aa区域进行表达；大肠杆菌BL21(DE3)、DNA Marker、低分子量蛋白Marker、DAB底物显色液等购自宝生物(大连)工程有限公司；山羊痘病毒抗体ELISA检测试剂盒购自山东绿都生物科技有限公司；Eu-荧光微球(粒径为210 nm)购自南京微测生物科技有限公司；EDC[1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐]购自Sigma公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自上海杰一生物有限公司；样品垫、结合垫、吸水纸、PVC板购自上海金标生物科技有限公司；其他试剂为国药分析纯。

1.3 主要仪器

超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；试纸条喷点平台购自美国BioDot公司；HGS201切条机购自杭州峰航科技有限公司；ZWYR-2102C恒温摇床购自上海智城分析仪器制造有限公司；MD-100干式荧光分析仪购自上海飞测生物科技有限公司。

1.4 P32重组蛋白的表达、纯化与鉴定

将pET28a-P32重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导6 h，收集菌体并超声，离心取沉淀溶于8 mol/L尿素溶液中，复性后用镍离子亲和层析法纯化目的蛋白。SDS-PAGE分析纯化蛋白，通过半干转印法将目的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶37 ℃封闭2 h，含0.5%吐温-20的Tris-HCl缓冲液(TBST)洗涤，加入1∶100稀释的GTPV抗体阳性兔血清4 ℃过夜，TBST洗涤后加入显色液，室温避光显色30 min观察鉴定结果。

1.5 试纸条的制备

1.5.1 微球标记

取固体含量为1%的Eu-荧光微球分散液100 μL，加入400 μL pH=8.0的硼酸缓冲溶液(BBS)，再加入20 μL 10 mg/mL的EDC溶液，室温活化30 min；12 000 r/min、4 ℃离心15 min，将沉淀洗涤1次，用500 μL BBS重悬；超声分散后，加入0.1 mg P32蛋白，室温孵育2 h，用终浓度1%的BSA在4 ℃过夜封闭；以12 000 r/min、4 ℃离心15 min，等体积复溶液(0.1%的BSA，BBS缓冲液)复溶，超声分散后置于2 ～ 8 ℃保存备用。

1.5.2 NC膜划线

以0.05 mol/L硼酸缓冲液为包被液，用点膜仪以50 mm/s的速度、5 μL/cm的剂量将稀释后的兔抗山羊IgG多抗、P32蛋白分别喷在NC膜的质控线(C线)、检测线(T线)位置，37 ℃烘箱中烘干2～3 h后密封备用。

1.5.3 结合垫的制备

将荧光微球标记的P32蛋白稀释成系列浓度，均匀的喷在结合垫上，37 ℃烘箱中烘干2～3 h后密封备用。

1.5.4 试纸条的组装

将NC膜、吸水纸、结合垫、样品垫依次贴于PVC底板上，用切条机切成4 mm宽的试纸条，装入卡壳，置于含干燥剂的铝箔袋内密封备用。

1.5.5 结果判定

将待检血清用pH=8.0的Tris-HCl溶液稀释100倍，吸取80 μL样品滴加到试纸条样品孔中，反应结束后在荧光分析仪上读取信噪比值(T/C)。参照标准[18]，当T/C<0.1时，判定为阴性；当T/C≥0.1时，判定为阳性。

1.6 试纸条反应条件的优化

1.6.1 划线浓度的优化

C线浓度设定为0.5 mg/mL，将T线划线浓度稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。检测GTPV阴性、阳性血清样本，通过荧光分析仪读取T/C，根据阳性血清(P)和阴性血清(N)比值，即P/N值筛选最佳划线浓度。

1.6.2 荧光微球复溶稀释倍数的优化

荧光微球按照50、100、200、400倍复溶，分别检测阴性、阳性血清样本，读取T/C值，根据P/N值确定合适的复溶稀释倍数。

1.6.3 反应时间的优化

加样后分别在5、10、15、20、25 min时读取数据，以T/C值稳定、P/N值最大且时间最短为最佳反应时间。

1.7 性能评价

1.7.1 特异性

用制备的荧光微球试纸条检测GTPV、CPIV3、PPRV、ORFV阳性血清及GTPV阴性血清，每份血清样本做3个重复，读取T/C值，以评价试纸条的特异性。

1.7.2 敏感性

将GTPV阳性血清参照品按2倍倍比稀释(1∶50～1∶1 600)，各取80 μL滴加于试纸条样品孔中，读取T/C值，以评价该试纸条的敏感性。

1.7.3 重复性

取同一批次和不同批次制备的荧光微球试纸条，分别对6份临床血清样品进行检测，每份血清做3个重复，读取T/C值，计算批内与批间变异系数(CV)。

1.7.4 稳定性

将同批次制备的试纸条干燥密封后置于37 ℃条件下进行加速老化试验，每天随机取出1组检测阴性、阳性血清，每组3个平行，读取T/C值。

1.8 临床样本的检测

采用优化后的试纸条对120份临床山羊血清进行检测，将检测结果与山东绿都ELISA试剂盒检测方法作对比，计算2种检测方法的符合率。

2 结果

2.1 P32蛋白的表达、纯化与鉴定

经SDS-PAGE显示在大约16 kDa处可见目的条带(图1A)，使用镍离子亲和层析法纯化得到P32蛋白，质量浓度为1.1 mg/mL；Western blot结果显示，重组蛋白可以与GTPV阳性血清发生特异性反应(图1B)，表明具有良好的反应原性。

M1. 蛋白Marker；1. 诱导后上清液；2. 诱导后沉淀；3. 纯化蛋白；M2. 预染蛋白Marker；4. 纯化蛋白与阳性血清反应。

2.2 试纸条反应条件的优化

2.2.1 划线浓度的优化

由图2中可知，当T线划线浓度为0.2 mg/mL时，P/N值最大，因此选择C线0.5 mg/mL、T线0.2 mg/mL为最佳划线浓度。

图2 T线最佳划线浓度确定

2.2.2 荧光微球复溶稀释倍数的优化

从图3中可知，当荧光微球按照200倍稀释复溶时，阳性血清T/C值较高，P/N值最大，因此选择200倍为最佳复溶稀释倍数。

图3 荧光微球最佳复溶稀释倍数确定

2.2.3 反应时间的优化

从图4可以看出，15 min后T/C值较稳定，P/N值最大，因此选择在反应时间为15 min时读取结果。

图4 最佳反应时间确定

2.3 性能评价

2.3.1 特异性

用制备的试纸条对CPIV3、PPRV、ORFV、GTPV阳性血清及GTPV阴性血清进行检测。结果显示，只有GTPV阳性血清检测结果T/C值大于0.1，其余均为阴性(表1)，表明该试纸条特异性良好。

表1 特异性试验结果

2.3.2 敏感性

将GTPV阳性血清按2倍倍比稀释(1∶50～1∶1 600)，稀释800倍时，T/C值仍大于0.1，为阳性，说明该试纸条的敏感性较高。

2.3.3 重复性

用同一批次与不同批次的试纸条对6份临床山羊血清检测，表2结果显示，批内变异系数小于10%，批间变异系数小于15%，说明该试纸条重复性较好。

表2 重复性试验结果(n=6)

2.3.4 稳定性

在37 ℃条件下进行加速老化试验，测得试纸条T/C值变化相对稳定(图5)，在7 d时仍可准确读出阴性、阳性血清。表明在37 ℃条件下至少可保存7 d，该试纸条稳定性较好。

图5 37 ℃条件加速老化试验

2.4 临床样品的检测

试纸条与ELISA试剂盒检测对比结果见表3，经ELISA方法检测的70份阳性血清中检出5份阴性，阳性符合率为92.86%；50份阴性血清中检测出4份阳性，阴性符合率为92%；总体符合率为92.5%，说明试纸条准确性较高。

表3 试纸条与ELISA检测结果

3 讨论

我国对山羊痘的控制主要通过接种疫苗来完成，羊痘弱毒疫苗在羊痘防控过程中发挥了巨大作用。由于该疫苗有效接种途径为尾部皮内注射，具有一定的接种难度，因操作失误等原因可导致疫苗免疫失败，使羊具有感染羊痘病毒的风险。国内外已建立了多种GTPV检测方法，常规的病毒中和试验应用表达荧光蛋白的重组羊痘病毒，使检测时间大大缩短[15]；有学者针对GTPV建立了快速、灵敏的PCR诊断技术，并已经研究出可同时识别山羊痘病毒和羊口疮病毒的PCR检测方法[19]；程汝佳等[20]选取ORF068基因保守区域设计引物，建立了GTPV环介导等温快速检测方法，与实时荧光PCR方法符合率达100%。赵宏吉等[21]以G9蛋白作为包被抗原建立的GTPV间接ELISA方法，证实与P32蛋白作为包被抗原建立的 ELISA方法的检测效果相似。

疫苗免疫抗体水平的现场快速监测对于成功预防羊痘具有重要意义，目前已有商品化的羊痘病毒ELISA抗体检测试剂盒，但因其对检测平台具有一定的要求，不适用于现场的快速检测。1983年，Soini等[22]首次提出将稀土离子为标记物引入到免疫分析领域，为FMIA检测方法的开创奠定了基础。该技术利用镧系元素Eu微球共价偶联标记抗原或抗体，比物理偶联更加牢固[23]。微球包裹及葡聚糖修饰技术确保了荧光离子不泄露、不受外界干扰，光稳定性好，而且Eu离子Stoke位移大，具有时间分辨功能，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度[24]。若能同时结合便携式荧光分析仪，操作简便，适于在基层推广应用。

GTPV抗体检测的靶蛋白中，P32蛋白是目前世界各国分离鉴定的毒株所共有的、特异性很强的结构蛋白[25]。其中，2～141 aa区域是P32蛋白的优势抗原区，本试验前期将该区域在大肠杆菌中进行截短表达、纯化获得重组P32蛋白，为荧光微球快速检测方法的建立提供了抗原基础。以荧光微球为标记材料对P32蛋白进行标记，以纯化的多抗IgG和P32蛋白分别包被试纸条的C线与T线，通过优化反应条件建立了GTPV抗体荧光微球免疫层析试纸条，丰富了GTPV快速检测方法。经评价，该试纸条只与GTPV阳性血清反应，与CPIV3、PPRV、ORFV的阳性血清均无交叉反应，特异性较强；阳性血清稀释至800倍仍能检出阳性，敏感性较高；随着时间的延长，信号强度会有所减弱，但T/C值相对稳定，批内变异系数小于10%，批间变异系数小于15%；与ELISA检测方法对比的总符合率为92.5%。

综上所述，本研究建立的基于P32蛋白的GTPV抗体荧光微球快速检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好、无需大型昂贵的仪器、操作简便等优势，可广泛应用于羊场中GTPV抗体的监测和流行病学调查。