海巴戟天对PCOS作用及机制的初步研究

许宝丹 付彦博 彭芸花

[摘要] 目的 利用超高效液相色譜-串联质谱技术（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）鉴定海巴戟天化学成分，进一步实验验证海巴戟天调控miR-223-3p/NLRP3信号通路抑制多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）大鼠炎症反应。方法 采用UPLC-MS/MS分析海巴戟天化学成分。动物实验：SD雌性大鼠采用随机数字表分为3组：正常对照组（n=5）、PCOS模型组（n=5）和海巴戟天灌胃组（n=5）。HE染色观察大鼠卵巢组织学形态，ELISA方法测定大鼠睾酮（testosterone，T）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、白细胞介素（interleukin，IL）表达水平，RT-qPCR法检测大鼠miR-223-3p、NLRP3的mRNA表达，Western blot法检测大鼠NLRP3的蛋白表达。结果 UPLC-MS/MS鉴定出海巴戟天化学成分有641种，包括木犀草素、芹菜素、大黄素等多种成分。与正常对照组比较，PCOS模型组卵巢颗粒细胞层数减少，卵泡囊性扩张，闭锁卵泡增多，T、LH水平升高（P<0.05），FSH水平降低（P<0.05），IL-18、IL-1β水平升高（P<0.05），卵巢组织miR-223-3p mRNA表达降低（P<0.01），NLRP3 mRNA和蛋白表达升高（P<0.01）；与PCOS模型组相比，海巴戟天灌胃组各级卵泡比例正常，颗粒细胞层数增多，T、LH水平降低（P<0.05），FSH水平升高（P<0.05），IL-18、IL-1β水平降低（P<0.05），卵巢组织miR-223-3p mRNA表达升高（P<0.05），NLRP3 mRNA和蛋白表达降低（P<0.05）。结论 海巴戟天能够改善PCOS大鼠卵巢病理状态，改变异常性激素及降低IL-18、IL-1β水平，其机制可能是通过调控miR-223-3p/NLRP3信号通路抑制PCOS大鼠炎症反应。

[关键词] 多囊卵巢综合征；海巴戟天；超高效液相色谱-质谱；miR-223-3p/NLRP3信号通路；模型大鼠

[中图分类号] R71       [文献标识码] A    [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.08.016

A preliminary study on the effect and mechanism of PCOS in Morinda citrifolia

XU Baodan1， FU Yanbo1， PENG Yunhua2

1.Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Affiliated to Hainan Medical University， Haikou 570216， Hainan， China; 2.Hainan Medical University， Haikou 571199， Hainan， China

[Abstract] Objective To use the ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） to authenticate the chemical composition of Morinda citrifolia， and further experiments verify that Morinda citrifolia regulate miR-223-3p/NLRP3 signaling pathway to inhibit the inflammatory response in rats with polycystic ovary syndrome（PCOS）. Methods Use UPLC-MS/MS analyze the chemical composition of Morinda citrifolia. SD female rats were randomly divided into three groups： normal control group （n=5）， PCOS model group （n=5） and Morinda citrifolia gavage group （n=5）. HE staining observe the morphology of ovarian histology， ELISA method detect the expression levels of testosterone （T）， luteinizing hormone （LH）， follicle stimulating hormone （FSH）， interleukin （IL）-1βand IL-18， RT-qPCR detect the mRNA expression of miR-223-3p and NLRP3， and Western blot detect the protein expression of NLRP3. Results UPLC-MS/MS identify 641 chemical composition of Morinda citrifolia， including luteolin， Apigenin， emodin and other composition. Compared with the normal control group， the number of cell layers of ovarian granule in the PCOS model group is reduced，and follicular cystic dilation， atresia follicles increased， T and LH levels increased （P<0.05）， FSH levels decreased （P<0.05）， IL-18 and IL-1β levels increased （P<0.05）， and ovarian tissue miR-223-3p mRNA expression decreased （P<0.01）， NLRP3 mRNA and protein expression increased （P<0.01） in PCOS model group. Compared with the PCOS model group， the proportion of follicles at all levels is normal， the number of granule cell layers increased， T and LH levels decreased （P<0.05）， FSH levels increased （P<0.05）， IL-18 and IL-1β levels decreased （P<0.05）， miR-223-3p mRNA expression in ovarian tissue increased （（P<0.05）， NLRP3 mRNA and protein expression decreased （P<0.05） in Morinda citrifolia gavage group. Conclusion Morinda citrifolia can improve the ovary pathological state of PCOS rats， change the abnormal sex hormones and reduce the levels of inflammatory factors IL-18 and IL-1β.The mechanism maybe regulate the miR-223-3p/NLRP3 signaling pathway to inhibit the inflammatory response in PCOS rats.

[Key words] Polycystic ovary syndrome; Morinda citrifolia; UPLC-MS/MS; miR-223-3p/NLRP3 pathway; Model rat

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是影响育龄期女性不孕的生殖内分泌疾病之一，表现为异常排卵、高雄激素血症、糖脂代谢紊乱等，还会引起子宫内膜病变、心血管病变等远期并发症[1]。PCOS病因不清，发病机制多样。Kelly等[2]首次提出慢性低度炎症可能介导PCOS的发生。PCOS的“炎症学说”逐渐成为研究热点。海巴戟天是茜草科巴戟天属植物，近些年越来越多的研究报道海巴戟天具有抗炎、抗氧化应激、抑菌等现代药理作用[3-4]。有研究表明海巴戟天能够抑制结肠炎的发展，还有研究表明海巴戟天的活性成分可以防治炎症性疾病[5-6]。海巴戟天具有广泛的抑炎作用，但目前在PCOS的相关研究不多。研究表明，miR-223-3p/NLRP3信号通路介导类风湿性关节炎、子痫前期等多种炎性疾病，但目前未发现有关miR-223-3p/NLRP3信号通路在PCOS炎症反应的研究[7-8]。本课题组前期细胞实验发现miR-223-3p与NLRP3存在结合位点，同时发现海巴戟天作用在PCOS颗粒细胞，能够上调miR-223-3p表达、下调NLRP3表达。基于前期研究基础，本次研究利用UPLC-MS/MS技术鉴定海巴戟天化学成分，通過动物实验验证海巴戟天调控miR-223- 3p/NLRP3信号通路对PCOS大鼠炎症反应的抑制作用。

1  材料与方法

1.1  实验动物

SPF级SD雌性大鼠，体质量（120±20）g，21日龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（粤）2022-0063。根据国家标准啮齿类实验动物要求进行喂养，实验动物自由进食饮水，适应性喂养。所有实验动物获得海南医学院伦理委员会的批准（伦理审批号：HYLL- 2021-127号）。15只SPF级SD雌性大鼠采用随机数字表法分为3组，即正常对照组、PCOS模型组和海巴戟天灌胃组，每组各5只。PCOS模型组和海巴戟天灌胃组大鼠，皮下注射DHEA0.06mg/g + 0.2ml甘油建立PCOS模型。正常对照组大鼠皮下注射等量生理盐水。在造模第21天时，连续进行7天阴道涂片，观察大鼠动情周期，当大鼠失去规律动情周期，睾酮（testosterone，T）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）水平降低视为造模成功。造模成功后，海巴戟天灌胃组大鼠予2.7g/kg的给药剂量灌胃，正常对照组与PCOS模型组大鼠予同等量的生理盐水灌胃，每天一次，连续灌胃21d。颈椎脱臼法处死大鼠后，解剖分离出大鼠卵巢，用4%多聚甲醛固定一侧卵巢组织，常规脱水、石蜡包埋，切片，显微镜下观察大鼠卵巢病理变化。

1.2  仪器与试剂

1.2.1  仪器  超高效液相（型号1290 UPHLC，美国Agilent公司）；高分辨质谱（型号Q Exactive Focus，美国Thermo Fisher Scientific公司）；离心机（型号Heraeus Fresco17，美国Thermo Fisher Scientific公司）；天平（型号BSA124S-CW，德国Sartorius公司）；研磨仪（型号JXFSTPRP-24，上海净信科技有限公司）；纯水仪（型号明澈 D24 UV，美国Merck Millipore公司）；超声仪（型号YM-080S，深圳市方奥微电子有限公司）；色谱柱（美国Waters公司）。

1.2.2  试剂  纯度LC-MS级甲醇、乙腈（CNW Technologies公司）；纯度LC-MS级甲酸（美国Sigma公司）；L-2-氯苯丙氨酸，纯度≥98%（上海恒柏生物科技有限公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。DHEA（美国Invivo Chem公司）；大鼠睾酮ELISA试剂盒、大鼠促卵泡素ELISA试剂盒、大鼠黄体生成素ELISA试剂盒、大鼠白细胞介素1β ELISA试剂盒、大鼠白细胞介素18 ELISA试剂盒（凡科维公司）；苏木精-伊红（HE）试剂盒（上海吉至生化科技公司）；qRT-PCR引物（北京擎科生物科技有限公司）；EastepSuper总RNA提取试剂盒[普洛麦格（北京）生物技术有限公司]；SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）、qPCRGreen Master Mix（翌圣生物科技股份有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、PVDF膜、BeyoECL Moon（碧云天生物技术有限公司）；NLRP3、内参GAPDH（英国Abcam公司）。实验用药海巴戟天干；生理盐水（四药公司，货号H13023200）。

1.3  UPLC-MS/MS

1.3.1  提取样品  称取100mg的样本，加入500μl提取液，通过冰水浴超声、乙腈涡旋、甲醇复溶、离心等步骤后取得上清液，备予上机检测。

1.3.2  色谱和质谱条件  色谱柱为UPLC BEH C18色谱柱（1.7μm×2.1μm，100mm）；进样体积为5μl。质谱条件：采用正/负离子模式，扫描范围为100～1500m/z；鞘气流速：45Arb；辅助气流速：15Arb；毛细管温度：400℃；全毫秒分辨率：70000；MS/MS分辨率：17500；喷雾电压：4.0kv（正极）或3.6kv（负极）。

1.4  检测miR-223-3p、NLRP3的mRNA与蛋白的表达

使用EastepSuper总RNA提取试剂盒从卵巢组织中提取总RNA，并将RNA反转录成cDNA，实时荧光定量PCR检测，按照T、LH、FSH试剂盒说明书步骤进行大鼠性激素检测，按照IL-18、IL-1β试剂盒说明书步骤进行大鼠炎性因子水平检测。取冻存的卵巢组织于研钵中，加入PMSF，于液氮中冻融、研磨，重复多次进行，离心后取上清液行蛋白定量（BCA法）检测蛋白浓度，在剩余蛋白样品中转移到SDS-PAGE缓冲胶上，然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭膜，并与一抗在4℃的温度下摇床孵育过夜。所有斑点用化学发光ECL试剂盒显示。

1.5  统计学方法

采用Graph Pad Prism9.5.0进行统计分析，计量数据以均数±标准差（）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2  結果

2.1  UPLC-MS/MS检测结果

UPLC-MS/MS鉴定海巴戟天主要化学成分，共分析鉴定出641种化学成分，包括木犀草素、芹菜素、大黄素等多种化合物，涉及黄酮类、萜类、苯丙素类等多种来源。

2.2  大鼠卵巢组织病理变化

对照组大鼠卵巢可见各级发育阶段中的卵泡，颗粒细胞层大多为8～9层，见结构正常的黄体；PCOS模型组大鼠卵巢卵泡囊样扩张及出现闭锁卵泡，亦可见颗粒细胞层数减少。与PCOS模型组相比，海巴戟天灌胃组大鼠各级卵泡比例趋于正常，颗粒细胞层数增加。见图1。

2.3  性激素与炎性因子水平变化

与对照组比较，PCOS模型组大鼠T水平升高（P<0.01），LH水平升高（P<0.05），FSH水平降低（P<0.05）；与PCOS模型组比较，海巴戟天灌胃组大鼠T、LH水平降低（P<0.05），FSH水平升高（P<0.05）。见图2。

与正常对照组比较，PCOS模型组大鼠IL-18水平升高（P<0.05），IL-1β水平升高（P<0.01）；与PCOS模型组比较，海巴戟天灌胃组大鼠IL-18、IL-1β水平降低（P<0.05）。见图3。

2.4  大鼠卵巢组织miR-223-3p、NLRP3的mRNA与蛋白表达

与对照组比较，PCOS模型组大鼠卵巢组织miR- 223-3p mRNA表达降低（P<0.01），NLRP3 mRNA表达升高（P<0.01）。与PCOS模型组比较，海巴戟天灌胃组miR-223-3p mRNA表达升高（P<0.05），NLRP3 mRNA表达降低（P<0.05）。见图4。

与对照组比较，PCOS模型组大鼠卵巢组织NLRP3蛋白表达升高（P<0.01）；与PCOS模型组比较，海巴戟天灌胃组大鼠卵巢组织NLRP3蛋白表达降低（P<0.01）。见图5。

3  讨论

PCOS是内分泌代谢紊乱与生殖功能受损并存的综合性疾病[9]。研究表明慢性低度炎症是PCOS发病基础，诱导PCOS出现胰岛素抵抗、高雄状态、卵泡发育异常，促进PCOS发生、发展[10-11]。研究发现，海巴戟天具有一定的抗炎作用，其提取物能够抑制炎性疾病，但在PCOS的作用研究不多。本研究结果显示海巴戟天化学成分有641种，包括木犀草素、芹菜素、大黄素等成分。研究发现木犀草素能够改变PCOS大鼠异常的性激素水平，减少多囊卵巢及卵巢黄体的凋亡[12-13]。Peng等[14]还发现芹菜素能够改善PCOS大鼠的脂代谢紊乱，抑制TNF-α和IL-6水平，同时对PCOS大鼠发挥保护性作用并能改善卵泡异常发育。此外还发现大黄素能够缓解PCOS大鼠卵巢病变、稳定性激素水平[15]。这提示海巴戟天对PCOS的发展具有抑制作用，但其中作用机制需进一步的实验研究。

因此从炎症反应角度出发，本研究通过DHEA方法构造PCOS大鼠模型，结果表明PCOS模型组大鼠卵巢病理形态发生改变，T、LH水平升高，FSH水平降低，以上判定PCOS大鼠造模成功。HE染色结果显示正常对照组大鼠卵巢颗粒细胞呈多层，各级发育的卵泡多见；PCOS模型组大鼠卵巢颗粒细胞层数减少，卵泡囊性扩张，闭锁卵泡增多；而海巴戟天灌胃组大鼠卵泡比例正常、颗粒细胞层数增多。ELISA检测结果显示海巴戟天能够降低PCOS大鼠T、LH水平（P<0.05），升高FSH水平（P<0.05），降低IL-18、IL-1β水平（P<0.05）。提示海巴戟天能够降低炎症因子表达，改善模型大鼠卵巢病理状态，改变异常的性激素水平。

NLRP3广泛参与多种疾病的炎症反应。研究发现，激活的NLRP3使下游因子IL-18、IL-1β表达增加，从而诱导了PCOS小鼠炎症反应[16-17]。miRNAs是近年来研究的热点因子，能够调节多种生物学过程。miR-223-3p被证实能靶向抑制下游分子NLRP3的表达，介导疾病的炎症反应过程[18-19]。刘雪琼等[8]研究了子痫前期胎盘的炎症反应，发现miR-223-3p通过靶向抑制NLRP3表达，抑制IL-18、IL-1β的释放，因而缓解子痫前期的炎症过程。Chen等[20]在对自身性心肌炎的研究中发现，上游信号miR-223-3p通过调控NLRP3的表达，以此能够改善心肌炎的炎症发生。miR-223-3p/NLRP3通路参与了多种疾病的炎症过程，但目前尚未发现miR-223-3p/NLRP3通路在PCOS炎症反应的作用研究。

本课题组前期细胞实验研究发现miR-223-3p与NLRP3存在结合位点，海巴戟天能够上调miR- 223-3p表达，抑制NLRP3表达。海巴戟天能够升高PCOS大鼠卵巢组织miR-223-3p mRNA表达（P<0.05），降低NLRP3 mRNA 和蛋白表达（P<0.05）。提示海巴戟天可能通过调控miR-223-3p/NLRP3信号通路介导对PCOS大鼠炎症反应的抑制作用。

综上所述，海巴戟天对PCOS模型大鼠具有抑制作用，并可能通过调控miR-223-3p/NLRP3信号通路抑制PCOS大鼠的炎症反应，从而缓解PCOS的发生发展，为海巴戟天應用于PCOS提供了初步的理论基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] BELLVER J， RODRIGUEZ-TABERNERO L， ROBLES A， et al. Polycysticovary syndrome throughout a womans life[J]. J Assisted Reprod Genet， 2018， 35（1）： 25–39.

[2] KELLY C C， LYALL H， PETRIE J R， et al. Low grade chronic inflammation in women with polycystic ovarian syndrome[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2001， 86（6）： 2453–2455.

[3] ZHANG K， MENG J， LI X J， et al. Noni （Morinda citrifolia L.） wine prevents the oxidative stress and obesity in mice induced by high-fat diet[J]. J Food Biochemistry， 2020， 44（11）： 1–14.

[4] ZHOU S Y， HUANG G L. Extraction， derivatization and antioxidant activity of Morinda citrifolia polysaccharide[J]. Chem Biolo Drug Design， 2022， 99（4）： 603–608.

[5] BATISTA J A， MAGALH?ES D A， SOUSAE S G， et al. Polysaccharides derived from Morinda citrifolia Linn reduce inflame matory markers during experimental colitis[J]. J Ethnopharmacol， 2020， 248（C）： 1–33.

[6] LEE D， YU J S， Huang P， et al. Identification of anti- inflammatory compounds from Hawaiian Noni （Morinda citrifolia L. ） fruit juice[J]. Molecules， 2020， 25（21）： 1–12.

[7] WU Z M， LUO J， SHI X D， et al. Icariin alleviates rheumatoid arthritis via regulating miR-223-3p/NLRP3 signaling axis[J]. Autoimmunity， 2020， 53（8）： 450–458.

[8] 刘雪琼， 祝淡抹， 杨燕， 等. miR-223-3p靶向NLRP3调控子痫前期胎盘中炎性反应的机制研究[J]. 现代妇产科进展， 2021， 30（5）： 335–340+345.

[9] GERANNE J， VANDER KOOI A L， BUSSCHBACH J， et al. Cognitive behavioural therapy for depression in women with PCOS： Systematic review and meta- analysis[J]. Reprod Biomed Online， 2022， 45（3）： 599–607.

[10] AKSHAY G， RUTUIA S， SHREYA P， et al. Polycystic ovary syndrome： An overview， diagnosis and treatment of pcos[J]. Asian J Pharmacy Technol， 2020， 10（4）： 265–272.

[11] HANCERLIOGULLARI N， TOKMAK A， GUNEY G， et al. Serum calprotectin levels as markers of inflammation， insulin resistance and hyperandrogenism in women with polycystic ovary syndrome[J]. Medicine， 2022， 101（51）： 1–6.

[12] TANIKAWA T I， KITAMURA M， HAYASHI Y， et al. Anti-inflammatory effects of morinda citrifolia extract against lipopolysaccharide-induced inflammation in RAW264 cells[J]. Medicines， 2021， 8（8）： 1–7.

[13] HUANG Y， ZHANG X. Luteolin alleviates polycystic ovary syndrome in rats by resolving insulin resistance and oxidative stress[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2021， 320（6）： 1085–1092.

[14] PENG F X， HU Y C， PENG S， et al. Apigenin exerts protective effect and restores ovarian function in dehydroepiandrosterone induced polycystic ovary syndrome rats： a biochemical and histological analysis[J]. Ann Med， 2022， 54（1）： 1–10.

[15] 楊永俊， 李铭， 曹丽幸， 等. 大黄素对多囊卵巢综合征大鼠卵巢功能及性激素水平的影响[J]. 北京中医药， 2022， 41（7）： 738–742.

[16] 丁杰， 倪喆鑫， 俞超芹. NLRP3炎性小體与妇科疾病相关性研究进展[J]. 中国生育健康杂志， 2021， 32（4）： 382–385.

[17] MOSTAFA R E， MORSI A H， ASAAD G F. Piracetam attenuates cyclophosphamide-induced hepatotoxicity in rats： Amelioration of necroptosis， pyroptosis and caspase- dependent apoptosis[J]. Life Sci， 2022， 303： 1–9.

[18] UDESEN P B， S?RENSEN A E， SVENDSEN R， et al. Circulating miRNAs in women with polycystic ovary syndrome： A longitudinal Cohort study[J]. Cells， 2023， 12（7）： 1–16.

[19] 赵景宏， 刘涛， 乔彦， 等. miR-223-3P通过抑制NLRP3炎性小体的活化减轻心肌细胞损伤[J]. 西部医学， 2022， 34（2）： 205–210.

[20] CHEN L Q， HOU X Y， ZHANG M M， et al. MicroRNA- 223-3p modulates dendritic cell function and ameliorates experimental autoimmune myocarditis by targeting the NLRP3 inflammasome[J]. Mol Immunol， 2020， 117： 73–83.

（收稿日期：2023–05–05）

（修回日期：2023–11–30）