茶树CsMCC1 和CsMCC2 基因的克隆及表达特征性分析

代洪苇 刘洁强 张 丽 童华荣 袁连玉

西南大学食品科学学院 / 川渝共建特色食品重庆市重点实验室, 重庆 400715

组蛋白乙酰化是一类可逆的组蛋白翻译后修饰(histone post-translational modifications, HPTMs), 由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰酶共同调节[1-3]。HPTMs 包括组蛋白的甲基化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化和乙酰化等, 这些表观修饰位点一般在H3和H4 核心组蛋白的N 末端, 使染色质构象发生变化,在控制基因转录、表观遗传学和其他DNA 模板化过程中起着重要作用[4-5]。组蛋白的乙酰化过程是HATs将乙酰辅酶A (acetyl-CoA)的CH3COO-基团转移到核心组蛋白N 末端的赖氨酸残基的ε-NH3位, 以中和赖氨酸残基上的正电荷, 使得染色质结构松弛,利于转录因子或转录调节蛋白与DNA 的结合, 而脱乙酰化则是一个相反的生物学过程[3,6-7]。所以, HATs参与的组蛋白乙酰化通常与基因的上调表达相关,而HDACs 催化的组蛋白去乙酰化与抑制性基因表达相关[8]。

组蛋白乙酰化在调节植物发育中的基因表达和植物对环境胁迫的响应中发挥重要作用[9]。水稻中发现组蛋白赖氨酸乙酰化与总酰化(包括丁酰化、乙酰化和巴豆酰化)的比值受环境和代谢信号的调节[10]。目前, 已经从拟南芥(Arabidopsisthaliana)[1]、葡萄(Vitisvinifera)[11]、水稻(Oryzasativa)[12]、番茄(Solanumlycopersicum)[13]、荔枝(LitchichinensisSonn. cv.)[14]、小麦(Triticumaestivum)[15]、麻(Cannabis sativaL.)[16]和地钱(Marchantiapolymorpha)[17]植物中分别鉴定出13、7、8、32、6、12、11 和7 个编码组蛋白乙酰转移酶的HATs基因。在模式植物拟南芥中, HATs 基因家族被分为4 类: GNAT (GCN5-related N-terminal acetyltransferases)亚家族的HAG1～HAG3(HISTONEACETYLTRANSFERASEOF THEGNATFAMILY)和MCC1基因; MYST (Moz,Ybf2/Sas3, Sas2 和Tip60)亚家族的HAM1和HAM2(HAIRYMERISTEM)基因; CBP (CREB-binding protein)亚家族的HAC1、HAC2、HAC4、HAC5和HAC12(HISTONEACETYLTRANSFERASEOFTHECBP FAMILY)基因; TAFII250 (TATA binding protein- associated factor)亚家族的HAF1和HAF2(HISTONE ACETYLTRANSFERASEOFTHETAFII250FAMILY)基因[1]。HATs 广泛参与各项生命活动, 包括细胞分化、分生组织功能、次生代谢物合成和胁迫应激反应等过程。在牵牛花中发现,GNAT是一类调控苯丙素类/类苯化合物生物合成及挥发的关键基因[18]。大麦GNAT 和MYST 亚家族的基因在种子发育的不同阶段表达, 并且能够被外源ABA 诱导[19]。AtMYST可以调节雌雄配子体的形成和发育, 当ham1ham2双突变后导致雄性和雌配子体形成受到阻碍[20]。CBP 可以通过影响主要开花抑制因子基因FLC(FLOWERINGLOCUSC)的表达来促进开花[21-22],而TAFII250 又可以调节控制细胞周期及光响应基因的表达[23-24]。HAG1, 又名GCN5(GENERALCONTROL NONDEREPRESSIBLE5), 是HAT大家族中被研究最广泛的基因。拟南芥AtHAG1对根系发育的干细胞维持及调节光诱导基因的表达发挥作用, 此外可以参与CBF1 (CRT/DRE binding factor 1)调节的低温应激响应[23,25-26]。玉米根部在盐胁迫处理后,ZmGCN5表达水平升高, 同时组蛋白的乙酰化水平上升[27]。但对于MCC基因的研究还很缺乏, 目前仅有2 篇文献报道了MCC1是编码GCN5 相关组蛋白N-乙酰转移酶的基因, 可以影响植物细胞的减数分裂过程[28-29]。研究发现MCC1在植物减数分裂过程中维持染色体的交叉互换和分离具有重要调控作用,AtMCC1表达升高导致拟南芥2 号染色体交叉互换缺失, 4 号染色体交叉互换数目增加[28];AtMCC1基因在拟南芥中过表达后, 发现花粉母细胞中组蛋白高乙酰化, 且导致控制精细胞减数分裂的基因失调[29]。

茶树[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]是重要的经济作物, 已经从茶树中鉴定出众多调控次生代谢、生长发育及胁迫响应的基因, 但关于茶树组蛋白乙酰化修饰的研究还很少。目前在茶树中鉴定了18 个CsHDACs基因, 在hd2c突变体中过表达CsHD2C可以恢复拟南芥对脱落酸(abscisic acid,ABA)和NaCl 的敏感性[30];CsHDA2与CsMYC2一起调控了茶绿叶蝉在侵染茶叶后诱导(E)-橙花醇的积累[31]。而HAT基因在茶树中的研究还未见报道, 仅在近源物种油茶(CamelliaoleiferaAbel.)中发现CfGCN5对油茶炭疽病有调节作用[32]。本研究从茶树基因组中鉴定克隆了2 个CsMCC基因, 并对其进行了全面的生物信息学分析和表达特性分析, 初步了解CsMCC基因的基本特征和功能特性, 可为茶树HAT基因的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为西南大学试验田种植的‘福鼎大白茶’ (Camelliasinensis(L.) O. Kuntze cv. ‘Fuding Dabaicha’)。取同一株茶树上的花、成熟叶、茎和根用于CsMCC基因克隆和组织特异性分析; 分别取同一时期不同发育状态的花、芽、叶和根用于CsMCC基因在各器官发育阶段的表达分析, 其中不同发育阶段的根部材料由‘福鼎大白茶’种子经萌发获得,以上材料均保存5 份以上。茶树CsMCC基因对外源GA3和IAA 的响应分析: 选择健康且生长势一致的2 年生福鼎大白茶扦插苗, 将茶苗根部泥土洗净后放入装有营养液的100 cm × 50 cm × 30 cm方盆中进行水培(每盆30 株, 共6 盆), 每盆中的茶苗分为对照组和试验组, 茶苗预培养3 周后分别用100 mg L-1赤霉素(gibberellic acid, GA3)和50 mg L-1生长素(indole-3-acetic acid, IAA)溶液喷施茶苗叶片的正反面, 在喷施24 h 和48 h 后取一芽二叶样, 以未经激素处理的茶苗为对照, 每个处理设置3 次重复。以上材料取下后均用锡箔纸包裹, 立即液氮速冻, 放于-80℃冰箱保存备用。

1.2 茶树CsMCC1 和CsMCC2 基因的克隆及生物信息学

以拟南芥AtMCC1 (AT3G02980)蛋白的氨基酸序列为参考, 在茶树基因库(tpdb.shengxin.ren)中进行Blast 搜索, 筛选相似性大于50%且具有GNAT 保守结构域的蛋白作为茶树CsMCC 候选蛋白, 并下载其核苷酸和蛋白序列。根据CsMCC候选基因的核苷酸序列设计克隆引物(表 1), 以茶树茎和花为cDNA 模板, 利用PCR 技术克隆茶树CsMCC基因。

利用NCBI 数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的ORF Finder 和CD-search 功能分析茶树CsMCC基因的开放阅读框和蛋白结构域; 分别运用MapChart、Plantcare (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和Gene Structure Display Server (http://gsds.gao-lab.org/index.php)软件分析基因的染色体定位、启动子顺式作用元件和基因结构。利用SOPM (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)、TMHMM-2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)预测蛋白质的二级结构、三级结构、跨膜结构和保守基序特征; 使用ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白质分子量和等电点等蛋白基本理化指标; 在STRING (https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=sTwl25wIT4pO&input_page_show_search=on)中利用模式植物拟南芥AtMCC1 蛋白的相互作用网络构建茶树CsMCC 蛋白的互作网络图;分别在拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)和 Phytozome 数据库(https://phytozomenext.jgi.doe.gov/blast-search)下载拟南芥AtHATs 家族成员和13 个不同植物中MCC 基因的蛋白质序列,采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)法构建进化树; 在DNAMAN 软件中对茶树和其他同源物种的MCC 的蛋白质序列进行多序列比对分析。

1.3 茶树CsMCC 蛋白的亚细胞定位

利用XbaI 和BamH I 酶双酶切pAN580-EGFP载体, 利用 PCR 扩增(引物见表 1)获得处理后的CsMCC基因扩增产物, 使用无缝连接试剂盒(BioRun)分别构建pAN580-CsMCC1-EGFP 和pAN580-CsMCC2-EGFP 融合表达载体。经DH5α 大肠杆菌(唯地生物)转化和测序鉴定, 对序列正确的单克隆菌斑进行菌液扩繁并提取重组质粒。分别将膜共定位信号Marker 与pAN580-CsMCC1-EGFP、pAN580-CsMCC2-EGFP 重组质粒共转化拟南芥原生质体, 28℃暗培养20 h 后, 在激光共聚焦显微镜(Nikon C2-ER) 下分别观察CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的亚细胞定位荧光信号, 并照相。

1.4 茶树CsMCC 基因的表达分析

采用植物RNA 快速提取试剂盒(艾德莱)提取茶树各样本RNA, RNA 质量检测合格后使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (全式金)反转录为cDNA 作为模板。为研究CsMCC基因在茶树生长发育中的作用, 采用qRTPCR 检测了CsMCC基因在茶树4 个组织器官和不同发育时期的花、芽、叶和根中的表达情况。为研究CsMCC基因对非生物胁迫和激素的响应情况,从茶树数据库中获得转录组表达的相关数据, 由此分析了茶树CsMCC基因在受到干旱、盐、冷和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)胁迫后的表达情况, 此外还检测了茶树在外源GA3和IAA 处理后CsMCC基因的表达量。基于扩增获得的CsMCC核苷酸序列, 利用Primer 3 设计qRT-PCR 引物(表1),以茶树肌动蛋白基因CsACTIN为内参基因[33], 根据SoFast EvaGreen Supermix (美国伯乐)试剂说明书设置反应体系和反应程序。每个样品包含3 次生物学重复, 每次重复含3 个平行, 采用2-ΔΔCT法计算相对表达量, 数据经标准归一化处理后在TBtools软件中绘制热图。

表1 PCR 扩增和基因表达分析的引物Table 1 Primers for PCR in tea plant

表2 茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的理化性质Table 2 Physicochemical properties of CsMCC1 and CsMCC2 proteins in tea plant

2 结果与分析

2.1 茶树MCC 基因的鉴定及克隆

以拟南芥AtMCC1 蛋白的氨基酸序列为参考, 在茶树基因组数据中进行Blast 搜索, 共获得2 个MCC同源蛋白(TEA029044 和TEA011651), 根据在染色体上的位置将其分别命名为CsMCC1 和CsMCC2。分别以茶树茎和花的cDNA 为模板, 克隆获得CsMCC1和CsMCC2基因片段(图1-A), 其CDS 长度分别为774 bp 和810 bp, 分别编码257 个和269 个氨基酸残基, 蛋白分子质量分别为29.34 kD 和30.69 kD。染色体定位分析结果显示, 2 个CsMCC基因分别定位于茶树基因组的1 号和7 号染色体(图1-B)。对茶树CsMCC和拟南芥AtMCC1的基因结构进行分析(图1-C)发现, 这2 个物种的MCC基因具有相同的外显子-内含子分布模式, 均含有4 个内含子和5 个外显子; 内含子相位类型高度一致, 即均有2 处“2”相位, 各有 1 处“0” “1”相位。CsMCC1 蛋白在185～209 aa 处存在 1 个跨膜结构(图 1-D), 而CsMCC2 蛋白无跨膜结构。由表 2 可知, 茶树CsMCC 蛋白的理论等电点分别为 9.44 和 8.22;CsMCC 蛋白不稳定指数分别为46.50 和46.13, 当不稳定指数小于 40 时为稳定蛋白; CsMCC1 和CsMCC2 蛋白亲疏水性值分别为-45.97 和-0.921,均小于0 (图1-E), 由此推测茶树的2 个CsMCC 蛋白均为碱性不稳定亲水性蛋白。

图1 茶树CsMCC 基因的克隆和理化性质分析Fig. 1 Cloning and physicochemical characterization of CsMCC genes in tea plant

2.2 茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白系统进化及蛋白保守结构域分析

系统进化树分析结果显示, 茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白与AtMCC1 同源, 属于HAT 基因家族中的GNAT 亚家族(图2-A), 且与葡萄(Vitisvinifera)、番茄(Solanumlycopersicum)、玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)的MCC 蛋白的亲缘关系较近(图2-B)。茶树CsMCC 和拟南芥AtMCC1 蛋白的保守基序高度保守, 均含有Motif 1/2/3/5/6 基序, 且基序排序一致, 此外茶树CsMCC 蛋白的C 端多了Motif 4 基序(图3-A)。MCC 蛋白具有GNAT 亚家族典型的GNAT 保守结构域, 且该结构域跨越了4 个保守基序, 即包含完整的Motif 3、Motif 6 基序及部分Motif 1、Motif 2 基序(图3-B, C)。基于茶树CsMCC蛋白的亲缘关系(图2-B), 分析茶树(CsMCC1/2)、拟南芥(AtMCC1)、葡萄(VIT_216s0039g01810)、番茄(Solyc03T002163)、玉米(Zm00001d017691)和水稻(LOC_Os02g46700)的MCC 蛋白同源序列(图3-C),发现不同植物中MCC 蛋白序列高度保守, 同源性为65.85%, 茶树与葡萄的MCC 蛋白序列一致性高达71.36%。

图2 HAT 蛋白家族(A)和植物MCC 蛋白(B)的进化树分析Fig. 2 Evolutionary tree of the HAT protein family (A) and plant MCC proteins (B)

2.3 茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白二级结构、三级结构分析

茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的二级结构分析显示(图4-A), 各二级结构在2 个茶树CsMCC 蛋白中的占比极为相似, 其中α-螺旋在CsMCC1和CsMCC2蛋白中的比例最大, 分别为35.41%和35.69%; 其次是自由卷曲, 分别为31.91%和31.97%; 延长链所占的比例分别为24.51%和22.68%, β-转角所占的比例最小。以已知蛋白6th0.1 为模板构建蛋白三级结构(图4-B)发现, CsMCC1 和 CsMCC2 蛋白与拟南芥AtMCC1 高度相似, 推测茶树的2 个CsMCC 蛋白与模式植物中的MCC1 蛋白存在相似的生物学功能。

图4 茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的空间结构分析Fig. 4 Spatial structure analysis of CsMCC1 and CsMCC2 proteins

2.4 茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的亚细胞定位分析

为明确茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的功能,将CsMCC基因构建到pAN580-EGFP 表达载体, 并在拟南芥原生质体中瞬时表达。由图5 可知, 通过激光共聚焦显微镜下观察到pAN580-CsMCC1-GFP和pAN580-CsMCC2-GFP 融合蛋白在细胞质膜上具有明显的绿色荧光信号, 且在细胞质膜上与膜定位marker 的红色荧光共定位, 表明 CsMCC1 和CsMCC2 蛋白在细胞质膜上发挥生物学功能。

图5 CsMCC 在拟南芥原生质体中的亚细胞定位Fig. 5 Subcellular localization of CsMCC in Arabidopsis protoplasts

2.5 茶树CsMCC1 和CsMCC2 基因的启动子顺式作用元件分析

为分析CsMCC1和CsMCC2基因在茶树中的潜在功能, 利用PlantCARE 软件分析了CsMCC1和CsMCC2基因上游2 kb 区域的启动子序列。由图6可知, 在茶树CsMCC基因的启动子序列中共发现31 种功能型顺式作用元件, 按照功能将其分为了五大类: 逆境胁迫响应、光响应、植物激素响应、代谢调节和其他元件。参与逆境胁迫响应的元件数量和种类最多, 以MYB、MYC 和STRE 元件为主;其次为光响应元件, 包括 BOX 4、GT1-motif、TCT-motif 和G-box 等元件; 在植物激素类中包括响应生长素(AuxR-core)、茉莉酸甲酯(CGTCAmotif 和TGACG-motif)、水杨酸(TCA-motif)和脱落酸(ABRE)的元件; 参与代谢调节的元件以碳代谢(AAGAA-motif)和精氨酸代谢(O2-site)为主。此外, 茶树CsMCC1 基因启动子序列中的顺式作用元件类型和数量比CsMCC2更丰富, 表明在茶树中CsMCC1具有比CsMCC2参与更广泛生理调节的潜能。

图6 CsMCC 基因启动子区域的顺式作用元件分析Fig. 6 Cis-elements detected in the promoter of the CsMCC genes

2.6 茶树CsMCC1 和CsMCC2 基因的时空表达特异性分析

为明确CsMCC1和CsMCC2基因在茶树生长发育过程中的调控作用, 本研究利用qRT-PCR 技术分析了CsMCC基因在茶树不同组织部位及各器官在不同发育阶段的表达模式。由图7-A 可知,CsMCC基因在茶树的花、叶、茎和根中均有表达, 但表达量的高低有所不同, 其中CsMCC1在茎中的表达量高于其他组织; 而CsMCC2在根中的表达量最高,在花、叶和茎的表达量几乎持平。在茶树芽的发育过程中(图7-B),CsMCC1基因表达呈现先增加后减少的趋势, 而CsMCC2基因随着芽成熟度的增加表达量下调。在茶树叶片的发育过程中(图 7-C),CsMCC1基因均衡表达,CsMCC2基因有先下降后上升的趋势并在老叶中表达量最高。在茶树花的发育过程中(图7-D),CsMCC1基因在茶树花开放初期(Flower-I)的表达量远高于后期的表达量;CsMCC2基因在花发育的Flowe-I、II 阶段有相对较高的表达量, 其次为 Flower-IV、V 阶段。由图 7-E 可知,CsMCC1基因在茶树幼根时期(Root I～III)有明显地高表达, 随着根部木质化程度的增加表达量下调;CsMCC2基因在茶树根发育的Root I～V 阶段均有较高的表达; 2 个CsMCC基因在根发育的VI 阶段时的表达量均较低。说明CsMCC1基因更倾向在茶树芽、花和根的幼嫩阶段表达,CsMCC2基因可能在茶树的根发育中有重要调控作用。

图7 茶树CsMCC 基因的时空特异性表达分析Fig. 7 Spatial-specific expression analysis of CsMCC genes in tea plants

2.7 茶树CsMCC1 和CsMCC2 基因对非生物胁迫和激素响应的表达特异性分析

为进一步分析CsMCC1和CsMCC2基因的功能,本研究基于TPIA 已公布的转录组数据和qRT-PCR技术分析了CsMCC基因在茶树受到非生物逆境胁迫和外源激素处理下的表达情况(图8)。在干旱胁迫(图 8-A)和外源 GA3 激素(图 8-E)处理条件下,CsMCC1和CsMCC2基因均被诱导上调表达。在盐胁迫中(图8-B),CsMCC1基因的表达受到明显的抑制;CsMCC2基因在48 h 内表达上调, 72 h 时表达也受到抑制。经冷驯化后(图8-C),CsMCC1基因被诱导表达上调, 而CsMCC2基因表达受到轻微抑制。在MeJA 处理条件下(图8-D), 2 个CsMCC基因的表达量均在24 h 内受到抑制, 在48 h 后表达上调。在外源IAA 处理后(图8-F), CsMCC1基因被明显地诱导上调表达; 而CsMCC2基因的表达先受到轻微抑制, 在48 h 后也被诱导上调表达。说明CsMCC1和CsMCC2基因均能被非生物胁迫和激素诱导表达且具有不同的表达模式。

图8 茶树CsMCC 基因在非生物胁迫和激素处理下的表达分析Fig. 8 Relative expression pattern of CsMCC genes under different abiotic stresses and phytohormones in tea plant

图9 CsMCC 蛋白的相互作用网络分析Fig. 9 Functional interacting network of CsMCC proteins

2.8 茶树CsMCC1 和CsMCC2 的蛋白关联蛋白分析

利用拟南芥同源AtMCC 蛋白进行了CsMCC蛋白的关联蛋白预测分析。由图 9 可知, 茶树CsMCC 蛋白与乙酰转移酶相关的多种蛋白存在关联性, 包含HAG1 (Histone acetyltransferase 1)、SGF29a/b (Saga associated factor 29 A/B) 、EMB2753 (Embryo defective 2753) 和 MAK10(MAK10 homologue)等蛋白, 此外还与细胞分化调节的CDC5 (Cell division cycle 5-like protein)蛋白具有相互作用, 进一步表明茶树 CsMCC1 和CsMCC2 蛋白具有通过组蛋白乙酰化作用参与调控茶树生命活动的潜能。

3 讨论

MCC 是一类编码GCN5-like N-乙酰转移酶, 属于HAT 家族的GNAT 亚家族[1], 植物中仅在模式植物拟南芥中有对AtMCC 基因功能的研究。本研究从茶树中获得2 个MCC基因(CsMCC1和CsMCC2), 其内含子-外显子分布和剪接模式与拟南芥AtMCC1完全一致, 蛋白结构和序列与其他植物也高度保守,说明 MCC 同源蛋白在植物的进化过程中都是高度保守的, 可参与调控细胞减数分裂过程的细胞行为[28-29]。2 个茶树MCC 蛋白均属于碱性不稳定性亲水蛋白,α-螺旋在其蛋白二级结构中的占比最高,这与HAT 家族蛋白的典型二级结构相似[34]。茶树CsMCC1 和CsMCC2 蛋白序列包含5 个保守基序,GNAT 结构域跨越了其中的Motif 1～3 及Motif 6 基序。GNAT 亚家族蛋白在植物、酵母和动物中均具有保守的GNAT 结构域, 该结构域由A～D 4 个保守基序构成, 说明茶树CsMCC 蛋白形成的复合物可能与动物和酵母类似[35-36]。Motif C 和D (茶树Motif 1 和 3)在维持蛋白质稳定性方面起重要作用, 而Motif A 和B (茶树Motif 6 和2)分别含有参与酰基辅酶A 和受体底物结合的残基[37]。茶树CsMCC1和CsMCC2 具有HAT 家族的GNAT 亚家族蛋白所需的必需结构元件, 具备植物组蛋白乙酰化酶的催化功能, 可以通过调控相关蛋白的乙酰化水平来调控其表达活性, 进而参与茶树的生长发育等过程的调控。

HAT 蛋白家族被报道广泛参与植物的形态建成、生长发育和逆境胁迫响应等调控过程[1]。小麦TaHAT基因在生长较快的组织中具有相对较高的表达水平, 且能够被冷胁迫诱导表达[15]; 陆地棉GhHATs在营养(根、茎和叶)和生殖(花托、花瓣、雄蕊、雌蕊和花萼)器官中广泛表达, 其表达也受到非生物胁迫和外源激素胁迫的诱导[38]; 栗子SiHAT2在叶片和茎中高表达, 但SiHAT4、SiHAT15和SiHAT18的转录水平非常低[34]; 麻CsHATs在雄花、根、茎、叶和种子中均具有较活跃的转录水平[16]。现有的文献报道发现MCC1与细胞分裂相关[28-29],细胞分裂是植物有性生殖和生长发育的基础, 一般发生在幼嫩组织和生殖器官, 在本试验中发现CsMCC1基因在茶树芽、花、根发育的幼嫩时期表达较高, 表明CsMCC1基因可能对茶树的形态建成和生殖生长具有重要调控作用。GCN5 组蛋白乙酰转移酶可通过调控PLETHORA基因的表达来调节根干细胞、分生区细胞的维持和伸长区细胞的增殖[26],CsMCC2基因在茶树根部有最大表达量, 且在根发育过程的较长时期内均有相对较高的表达, 说明CsMCC2基因在茶树根干细胞维持和根生长发育过程中发挥了重要作用。此外, 茶树CsMCC1和CsMCC2基因的启动子序列中包含多个逆境胁迫、激素响应和光响应顺式作用元件, 且在转录组数据和表达分析中也发现茶树CsMCC基因能被非生物胁迫和外源激素诱导表达。茶树2 个CsMCC基因在干旱、外源GA3和IAA 激素胁迫下均被上调表达,而在盐、冷和MeJA 胁迫中表现出不同的表达模式,表明2 个CsMCC基因在茶树响应部分外界环境刺激时具有协同调节的能力, 而在一些环境胁迫时表现出不同的表达模式, 这更利于茶树适应外界环境。

多种植物的HAT 蛋白被报道定位于细胞核, 少数定位于细胞质和叶绿体[12]。茶树CsMCC1 蛋白和CsMCC2 蛋白则定位于细胞膜, 与其他植物中报道的HAT 的亚细胞定位不同。在CsMCC1 蛋白中还预测到1 个跨膜结构, 推测MCC 蛋白可能是通过调控位于细胞膜上的目标蛋白的乙酰化修饰水平来参与植物细胞的分裂和伸长过程, 但还需要通过更多的试验数据来探索MCC 蛋白的具体调控途径和蛋白作用网络。本研究初步发现MCC 蛋白可以与HAG1、SGF29a/b、EMB2753 和MAK10 等多个蛋白具有相互作用和关联性, 后续还将进一步验证该关联调控网络。综上, 茶树CsMCC基因具有参与调控茶树形态建成、生长发育和逆境胁迫响应等过程的潜能,但其详细作用机理及其是否是通过乙酰化修饰作用参与调控还需要更深入的研究。

4 结论

本研究从茶树中克隆获得2 个MCC 类HAT 蛋白基因:CsMCC1和CsMCC2, 属于碱性不稳定亲水性蛋白, 均定位于细胞质膜。2 个CsMCC 蛋白在基因结构、蛋白结构及保守基序等方面与其他植物的MCC 蛋白高度保守, 含有典型的GNAT 保守结构域,且与葡萄和番茄的亲缘关系较近。CsMCC1和CsMCC2基因的表达在茶树中具有时空特异性, 且能够受到非生物逆境胁迫(干旱、盐和冷胁迫)和外源植物激素 (MeJA、IAA、GA3)的诱导表达。CsMCC1和CsMCC2 蛋白与乙酰化转移酶相关的多个蛋白具有关联性。综上, 通过本研究推测茶树CsMCC1和CsMCC2基因具有通过组蛋白乙酰化修饰作用参与茶树的生长发育和非生物逆境胁迫响应过程的潜能。