高效液相色谱-串联质谱法同时测定植物药酒中9种有毒生物碱

摘 要：本文建立植物药酒中9种有毒生物碱的高效液相色谱-串联质谱分析方法。实验优化了提取条件、仪器条件等参数，样品超声提取、离心后过滤。采用Waters BEH色谱柱分离，在多反应监测模式下测定，外标法定量。结果显示，在各自范围内9种生物碱具有良好的线性关系，相关系数R2＞0.99，方法的定量限为2.5～25 μg/L，总体平均回收率＞80%，总体相对偏差＜10%（n =6）。该方法对植物药酒中9种有毒生物碱快速、准确的测定十分有效。

关键词：植物药酒，有毒生物碱，HPLC-MS/MS

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-59442025.04.035

0 引 言

我国中草药资源丰富，使用药酒养生治病也有着数千年的历史[1-2]。民间流传许多药酒偏方，很多人存在“中药安全可以随便吃”的错误观念，因此自制药酒的现象比较普遍。饮用自制药酒而导致的中毒事件时有发生，经案例分析可知，此类事件多为误服植物药酒中的生物碱所致[3-4]。

生物碱是许多中草药的有效成分，其具有抗癌、强心、镇痛、降血压等生理药理活性[5]，但部分生物碱毒性大。在中药不良反应事件中，由生物碱导致中毒的事件所占比重很大，如毛莨科的乌头含有乌头碱，卫矛科的雷公藤含有雷公藤甲素等。以乌头类生物碱为例，口服0.2 mg 就可使人中毒，3～5 mg 即可致死，致死剂量与中毒剂量接近[6]。因此，民间使用含生物碱的药草自行浸泡药酒，有着极大的安全隐患。

目前，生物碱的测定方法主要有高效液相色谱法[7]、气相色谱-质谱法[8]和液相色谱串联质谱法等[9-11]，这些方法大多只测定某一种（如乌头碱）或某一类中几种生物碱（如莨菪烷类生物碱，莨菪碱、东莨菪碱等）。市场监管总局近年来新发布了《食品补充检验方法 BJS201711畜肉中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因的测定》《食品补充检验方法 BJS202108蜂蜜中雷公藤甲素的测定》，说明国家对有毒生物碱非常重视。本研究在查阅文献后选择9种生物碱，这9种生物碱毒性较强，多具有祛湿、镇痛、降血压等功效且易为民间使用[3-4，9-10]。开发同时检测9种生物碱的方法，既有效地应对突发中毒事件中快速筛查引起中毒的物质，又使民众意识到自行浸泡药酒的不安全性，规范植物浸泡药酒领域，为人民群众生命安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）仪器高效液相色谱-串联质谱仪129 0 -6470（美国Agilent公司）；minilab全自动稀释配标仪（美国Labtech公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；Vor tex-5涡旋仪（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；H-210 0 R高速冷冻离心机（湖南湘潭湘仪仪器有限公司）；超声波清洗机（江苏张家港三友超声设备有限公司）；C18色谱柱（3.5 μm，2.1 mm×10 0 mm，瑞典SVEA公司）；ACQUII Y UPLC BEH Shield R P18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司）；InfinitylabPoroshell 120 Ec-C18色谱柱（2.7 μm，2.1mm×100 mm，美国Agilent公司）。

（2）试剂乌头碱对照品：含量≥97.9%（美国Chromadex）；钩吻碱对照品：含量≥98%（加拿大TRC公司）；石蒜碱对照品：含量≥99.8%（美国IL公司）；鬼臼素酯对照品：含量≥99.6%（中检所）；番木鳖碱对照品：含量≥99.2%（德国LGC公司）；雷公藤甲素对照品：含量≥98%（中检院）；秋水仙碱对照品：含量≥95.4%（英国LGC公司）；东莨菪碱对照品：含量≥99.9%（英国LGC公司）；山莨菪碱对照品：含量≥98%（美国IL公司）；甲醇、乙醇色谱纯（德国默克）、甲酸质谱级（日本东京化成工业株式会社）、甲酸铵、氟化铵色谱纯（FLUKA）。

1.2 方法

（1）标准溶液制备 标准储备液：分别称取适量的乌头碱、钩吻碱、石蒜碱、鬼臼素酯、番木鳖碱、雷公藤甲素、秋水仙碱、东莨菪碱、山莨菪碱10 mg置于50 mL容量瓶中，用体积分数为20%的乙醇溶液溶解并定容至刻度线，摇匀，得到质量浓度为200mg/L的储备液，-20℃避光保存，有效期3个月。根据实验需要，用20%的乙醇溶液将标准储备液配制成所需浓度的标准工作曲线，现用现配。

（2） 样品制备 取样前将样品混匀。称取药酒2mL于离心管中，超声，用水定容至10 mL，8000 r/min离心5 min，吸取1.0 mL上清液，过0.22 μm滤膜，滤液供HPLC-MS/MS测试。空白实验除不加试样外，均按照上述操作步骤开展。

（3）色谱-质谱条件

1）色谱条件Waters ACQUIIY UPLC BEH ShieldRP18色谱柱（1.7 μm， 2.1 mm×100 mm）；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：2 μL；流动相：A为4.5 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸水溶液，B为4.5 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱。

2 ）质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI）；检测方式：多反应检测模式（MRM）；毛细管电压：4 kV；干燥气温度：300 ℃；干燥气流量：6 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流量：11 L/min；9种有毒生物碱的质谱参数见表2。

1.3 定量方法的确立

分别向空白基质样品中添加1、2、10倍定量限3个水平浓度的9种有毒生物碱标准物质，每个水平浓度设置6个平行样品，按照前处理方法进行实验测定，外标法定量，验证方法的回收率及计算相对标准偏差。

1.4 基质效应

基质效应是指样品中除目标分析物外的其他组分对待测物质的分析过程有显著干扰、抑制或增强目标分析物响应的现象。采用相对响应值法，定量测定空白基质提取液配制的标准溶液与体积分数为20%乙醇溶液中相同质量浓度待测物的响应值，通过二者的相对比值来评价基质效应：

基质效应 （%）=B/A×100%

其中，A为体积分数为20%乙醇溶液配制标准溶液的响应值；B为空白基质提取液配制标准溶液的响应值。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

通过查阅文献及实际应用综合考虑，遇到突发中毒事件时，须快速、准确判断中毒物质，为临床的诊断和对症治疗提供可靠依据。植物药酒的成分为乙醇及少量草本浸出物，可经过稀释和过滤的方式处理样液[12-13]。选取不同的溶液对样品进行稀释，考察进样后的分离情况，对比后采取加水稀释过膜进样。实验结果表明，此法能够得到较好的色谱峰形及分离度。

2.2 质谱测定条件的优化

将9种有毒生物碱标准物质储备液配制成质量浓度为1 μg/mL的单标溶液，进行质谱测定参数优化。通过对目标物结构式的分析，在正离子模式下更易得到一个H+形成准分子离子峰[M+H]+，因此实验选择正离子模式。通过全扫描模式找到母离子，优化碎裂电压，得到子离子峰，选取丰度较强、干扰较小的离子作为定性、定量离子并优化其碰撞能量。

2.3 色谱柱的选择及分离条件的优化

通过分析目标物的化学性质，选择3种色谱柱：Thermo Hypercarb HT （2.1 mm×100 mm，3 μm）；Waters ACQUIIY UPLC BEH Shield RP18色谱柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm）；Agilent ZORBAX EclipsePlus C18 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），对目标物的分离效果做了比较。结果表明，使用Ther mo色谱柱时，雷公藤甲素几乎没有基线分离，石蒜碱的峰型拖尾且响应值偏低；使用Agilent色谱柱时，番木鳖碱的峰型拖尾，目标物整体响应值偏低；使用Waters色谱柱时，目标物实现基线分离，整体峰型良好，与其他色谱柱相比响应值最高，因此选择Waters色谱柱。

本研究分别考察了0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水溶液（含4.5 mmol/L甲酸铵）+ 0.1%甲酸甲醇溶液（含4.5 mmol/L甲酸铵）混合溶液体系作为流动相，对目标物分离情况和离子化情况的影响。结果表明，当含甲醇混合溶液体系作为流动相时，化合物的响应值明显较高，加入4.5 mmol/L甲酸铵后，化合物峰型明显改善。因此，确定0.1%甲酸水溶液（含4.5 mmol/L甲酸铵）+ 0.1%甲酸甲醇溶液（含4.5 mmol/L甲酸铵）混合溶液体系作为流动相。

2.4 方法的线性范围和检出限、定量限

用20%乙醇溶液配制质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列标准工作溶液。以目标化合物质量浓度为横坐标，以定量子离子的质谱响应值为纵坐标，得到线性回归方程，目标物的相关系数R 2均高于0.99。采用加标回收的方法确定方法的检出限和定量限，分别以3、10倍信噪比为方法的检出限和定量限。目标物的线性方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限见表3。

2.5 方法的回收率和精密度

采用空白样品加标的方法进行添加回收率和精密度实验。在空白样品中添加低、中、高3个水平的标样后，然后按照方法进行操作，每个添加水平平行测定6次。同时配制标准系列溶液，计算回收率和相对标准偏差，结果见表4。结果表明，在低、中、高3个添加水平的平均回收率介于85%～120%，相对标准偏差为0.8%～9.0%。表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。

2.6 基质效应的评价结果

9 种有毒生物碱质量浓度为2 0 μg / L ，平行测定3次。结果显示，除石蒜碱（43.4%）、鬼臼毒素（122.1%）基质效应较为明显，其余化合物的基质效应为89.1%～106.8%。

2.7 实际样品的测定

使用本研究建立的方法，在天津市抽取自制药酒30份进行测定，目标物均未检出。抽检区域分布数据表明，天津市区县的认可度高于市内六区；抽检样品类别数据表明，天津市民众饮用的药酒多为滋补类，如人参、枸杞等，暂不涉及具有镇痛、降血压等功效的植物药酒，因此检出9种有毒生物碱的概率较低。

3 结 论

本研究建立的方法具有操作简便、准确度高、污染小的特点。在遇到突发中毒事件时，该方法可快速检测药酒样本、准确判断导致中毒的物质，为临床的诊断和对症治疗提供可靠检测依据，同时也为相关监测机构提供技术支撑，有着较高的实际应用价值。

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作者简介

郭文丽，硕士，高级工程师，研究方向为食品质量与安全。

翟雨佳，通信作者，硕士，高级工程师，研究方向为食品质量与安全。

（责任编辑：张佩玉）