信阳市罗山县鸡滑液囊支原体PCR检测及VlhA基因序列分析

摘 要：为了解信阳市罗山县MS流行状况和流行株的分子特征，本研究应用PCR方法对罗山县部分蛋鸡养殖场进行鸡滑液囊支原体病原检测，并对阳性样品VlhA基因进行序列分析。结果表明，从48份样品检测出3份MS阳性样品；VlhA基因序列分析表明，3个流行株与国内流行的K基因型MS参考株具有高度相似性；VlhA基因推导氨基酸序列分析表明，3个流行株与国内流行的MS具有高度同源性；氨基酸变异位点分析发现，H2 MS阳性样品在第43、45位出现突变与缺失。研究结果为罗山地区MS流行病学研究提供了一定的参考。

关键词：鸡滑液囊支原体；PCR检测；VlhA基因；序列分析能

禽支原体病主要由鸡败血支原体（Mycoplasma gallisepticum， MG）和鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae， MS）引起，是影响养禽业中一种极为重要的疾病。它可导致家禽体重增长减少、饲料转化效率下降、产蛋量减少、孵化率降低、胚胎死亡率增加、胴体废弃率上升、预防和治疗成本增加，从而造成巨大的经济损失[1]。鸡滑液囊支原体病是由滑液囊支原体引起的普遍存在于全球养殖场内的一种疾病，养殖环境中的各种因素如鸡群密度、繁殖季节和环境变化等都对该病的流行有很大影响。该病一旦发生，将会对家禽养殖业造成重大的经济损失[2]。鸡滑液囊支原体病的主要症状包括关节渗出性滑液囊炎和腱鞘炎、呼吸道症状、生长缓慢、死亡率增加，尤其是引发产蛋下降、蛋壳品质降低以及蛋壳尖端缺陷（Eggshell apex abnormalities， EAA）等一系列问题，备受大家关注[3]。

近年来，国内外MS的发生率不断增加，不同年龄、品种和地区均可发生，特别是嗜输卵管MS的发生，给国内家禽养殖企业造成了巨大的经济损失[4]。目前，MS只有1个血清型，根据Jeffery等[5]建立的可变脂蛋白凝血素 A（VlhA）5′ 端序列分析方法，目前已发现了A～K等16种基因型[6]。VlhA基因测序分析已成为研究鸡滑液囊支原体的重要方法之一，为鸡滑液囊支原体病的防控提供了更准确、科学的数据支持[7]。本研究目的是应用PCR方法进行MS病原检测及VlhA基因序列分析，弄清信阳市罗山地区MS流行状况和流行株的分子特征，为当地鸡滑液囊支原体病的防控提供更为准确的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 本试验样品采集自信阳市罗山县高店乡、尤店乡、东铺镇、潘新镇等4个地区疑似发生MS感染的蛋鸡养殖场，通过对有明显呼吸系统病变、产蛋量和产蛋性能及产蛋质量下降的病鸡进行咽拭子采集，共采集48份样品，标记后进行实验室保存。

1.1.2 主要试剂 TAE电泳缓冲液、LB培养基、DNA凝胶快速回收试剂盒等，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Rapid Taq Master Mix、FastPure@ViralDNA/RNA Mini Kit Pro试剂盒、质粒提取试剂盒与连接转化相关试剂，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考NYT5553-2015合成MG、MS PCR检测引物。参考Jeffery等[5]设计合成MS VlhA基因扩增引物。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体信息见表1。

中图分类号：S858.31 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2025）02-0019-07

收稿日期：2024-06-27

基金项目：信阳农林学院科技服务团队项目（2022FWTD）；信阳农林学院青年教师科研基金项目（QN2023019）；

信阳农林学院科技创新团队资助项目（KJCXTD-201901）

第一作者：李迎晓（1981—），副教授，从事兽医病原微生物与免疫学研究，E-mail： liyingxiao81@163.com

通信作者：焦凤超（1979—），副教授，从事兽医病原微生物与免疫学研究，E-mail： fengchaojiao@163.comm

1.2.2 样品DNA提取 将采集的气管或输卵管棉拭子按照FastPure@ViralDNA/RNA Mini Kit Pro试剂盒说明书提取样品DNA，将提取后的DNA模板放置-20 ℃保存。

1.2.3 病原PCR检测 利用特异性MGF、MGR引物检测败血性支原体；利用MSF、MSR引物检测滑液囊支原体。PCR反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃ 变性15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 延伸5 s，35个循环；72 ℃ 延伸1 min。

1.2.4 VlhA基因的PCR扩增和序列分析 利用滑液囊支原体分型特异性引物配置50 μL的PCR反应体系：2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL，PCR扩增程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃ 变性15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 延伸5 s，35个循环；72 ℃ 延伸1 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统观察并记录结果。将阳性条带的胶回收产物分别连接5 min TOPO-Blunt Cloning Kit，将重组质粒用M13F/R通用引物PCR检测无误后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用DNAStar软件和MEGA软件与GenBank中公布的参考毒株VlhA基因和推导氨基酸序列进行相似性比对和遗传进化树的构建。参考菌株序列信息见表2。

2 结果

2.1 临床样品的PCR检测

PCR结果表明：从信阳市罗山县4个乡镇的部分蛋鸡养殖场中采集的48份样品中，有3份样品PCR扩增出了200 bp左右条带（图1），与预期片段大小相符，检出率为6.25%，初步证明3份阳性样品疑似鸡滑液囊支原体感染，分别命名为H1 MS、H2 MS、H3 MS。

2.2 VlhA基因的PCR扩增

对3份阳性样品进行VlhA基因进行PCR扩增，均扩增出400 bp左右条带，与预期片段大小相符，结果显示见图2。

2.3 VlhA基因序列分析

序列分析显示，流行株H1 MS、H2 MS、H3 MS与国内参考株KU572343、KU572326、KU572314、KU572344、KU572324、KU572379、KJ606947、FM164344、MH679910核苷酸相似性较高，在96.4%～100%之间，而与其他基因型参考株的相似性（94.0%～96.4%）较低，其中H3 MS与KU572343、KU572326、KU572314、KU572344、KU572324这5株来自国内的K基因型的参考株相似性最高，为100%；其他2株流行株与这5株参考株相似性稍低（图3）。由图4可知，3个流行株与国内K型参考株KU572343、KU572326、KU572314、KU572344、KU572324、KU572379亲缘关系最近，处于同一分支。因此表明3株阳性样品毒株均属于K基因型。

2.4 VlhA氨基酸序列分析

推导氨基酸序列比对结果显示，流行株H1 MS、H2 MS、H3 MS与国内的KU572344、KU572326、KU572343、KU572314、KU572324氨基酸相似性最高，在95.2%～100%之间，处于同一分支，亲缘关系最近（图5）。

氨基酸变异位点分析显示，3株流行株与其他16株参考株VlhA氨基酸位点存在13处差异位点，特别是H2 MS与其他菌株相比存在43位（D→N）、45位（V→/）变异见表3。

3 讨论

近年来，滑液囊支原体引发的疫情报道在我国、日本和美洲国家的养鸡场内屡见不鲜，一度成为高频率传染疾病[8]。Sun等[9]对2010—2015年间中国16个省的9 773个地方鸡群进行MS流行病学调查，结果表明，MS在中国地方种鸡中广泛流行，在种鸡胚胎中MS的感染率高达16.29%。

MS可以水平传播，但其经蛋垂直传播的危害更大。邵延福等[10]发现蛋鸡感染MS后，可导致种蛋在孵化后期死亡，或孵出携带MS的弱鸡而成为重要的传染源。鸡在不同阶段感染MS，会有不同的临床表现。MS可以在鸡体内长期潜伏，从外观正常鸡的器官中也能分离出滑液囊支原体，在不良环境因素的刺激下，鸡群将迅速发病，持续感染给家禽养殖业造成重大损失。被MS感染的病鸡精神差、羽毛粗乱、不运动，患病鸡滑膜囊出现囊肿，足底肿胀，有溃疡或结痂，甚至不能站立和行走。产蛋鸡群感染后出现产蛋突然下降、蛋壳质量差和无壳蛋、软壳蛋增多等症状[11]。本研究通过对信阳市罗山县高店乡、尤店乡、东铺镇、潘新镇等4个地区的部分蛋鸡养殖场的病鸡群进行观察记录，发现部分病鸡群的鼻腔与眼睛出现粘性分泌液，蛋鸡出现产蛋量下降、蛋壳质量下降以及产出“太阳蛋”等症状，部分病鸡还出现部分关节肿大、腱鞘与滑膜囊出现囊肿病变，鸡冠多呈现苍白、萎缩等，这些临床表现与感染鸡滑液囊支原体病的临床症状高度相似，进一步进行PCR检测，检出3份鸡滑液囊支原体阳性样品，证实了发病鸡群感染鸡滑液囊支原体并伴有明显的临床症状，为地方鸡滑液囊支原体流行病学提供了参考。

目前MS存在16种不同的基因型（A～K）。其中A～J基因型均由国外研究所发现，而K基因型在我国首次发现[12]。谢迪等[6]于2016—2019年从江苏、安徽、山东、河南、河北、宁夏、黑龙江、湖北等8个省份疑似发生MS感染的鸡场采集样品，进行MS菌株的分离鉴定，结果共获得48株MS分离株，其中46株为K基因型。Sui等[13]于2017—2019年间对中国中部地区258个鸡群进行了MS调查，共分离出129株MS菌株，81.4%分离株为L型。分析发现，2017年的流行类型包括I型和L型；2018年的类型增加到5种（A、D、E、I、L型），2019年增加到6种（A、D、E、I、J、L型），说明中国中部地区MS的基因型具有多样性。翟路峰等[14]对2019—2022年在我国河南、河北、山东、安徽、江苏 5个省份收集的152份疑似MS感染的鸡病料进行MS分离鉴定和基因分型，结果显示：共分离到29株MS菌株，除其中1株为E型外，其余28株均为L型。以上结果说明我国不同区域存在不同基因型MS菌株，迫切需要加强家禽群中MS的实时监管控制。

本研究对采集自信阳罗山县部分地区的MS阳性样品菌株进行PCR目的基因扩增，并对不同地方的参考菌株进行VlhA基因序列比对，进一步开展推导氨基酸序列分析，并构建分子遗传进化树，研究结果表明3株阳性样品菌株均与国内基因分型为K基因型的参考株KU572326、KU572314、KU572344、KU572324、KU572379、KU572343同源性最高，表明罗山地区流行的MS基因分型属K基因型，说明当地流行株的传染源仍然来自国内[15]，因此应加强传播途径、防控措施等方面的进一步研究。

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PCR Detection and VlhA gene sequence Analysis of Mycoplasma Synoviae in Chickens from Luoshan County， Xinyang City

LI Yingxiao， YIN Lei， HU Yuman， ZHAO Yu， JIAO Fengchao

（College of Animal Science and Technology， Xinyang Agricultural and Forestry University，

Xinyang 464000，China）

Abstract： The study aimed to understand the prevalence and molecular characteristics of Mycoplasma synoviae （MS） strains in some egg layer farms in Luoshan County， Xinyang City. PCR methods were applied to detect MS in the samples， and the positive samples' VlhA gene was cloned for sequence analysis. The results showed that out of 48 samples， 3 were positive for MS. The analysis of the VlhA gene sequences indicated that the three prevalent strains had a high degree of similarity with the domestic K genotype MS reference strains. The deduced amino acid sequence analysis of the VlhA gene revealed a high degree of homology between the three prevalent strains and the domestic MS strains. Analysis of the amino acid mutation sites found that the H2 MS positive sample had mutations and deletions at positions 43 and 45. The findings provide a reference for the epidemiological study of MS in the Luoshan area.

Keywords： Mycoplasma synoviae; PCR detection; VlhA gene; Sequence analysis