循环排列的增强型绿色荧光蛋白的构建及性能表征

DOI：10.16601/j.cnki.issn2096-7330.2025.01.010" ""文章编号：2096-7330（2025）01-0086-08

摘 要：荧光蛋白的自催化稳健荧光和无细胞毒性特性，使其成为监测细胞内信号分子的关键工具。然而，循环排列的荧光蛋白（Circularly Permuted Fluorescent Proteins，cpFPs）仍存在着自身强度弱和无法适用于复杂细胞环境内检测等问题，因此，获得更多类型的循环排列荧光蛋白并研究其光学活性和物理性能具有重要意义。构建一种新型的循环排列荧光蛋白——cpEGFP，并探究不同温度下cpEGFP在Escherichia coli BL21菌株的表达效果，同时比较其与超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）的光学特性，发现cpEGFP的发色团环境已经被改变，且荧光寿命有所延长。另外，尽管cpEGFP具有可观的荧光强度，但其亮度及量子产率比sfGFP都有所降低，后续需要进一步对其性能进行优化。研究结果为循环排列荧光蛋白cpEGFP的性能优化以及在细胞内信号分子检测中的应用奠定了基础，对于发展更为高效、特异的荧光探针具有重要意义。

关键词：循环排列绿色荧光蛋白；超折叠绿色荧光蛋白；诱导表达；相对荧光量子产率；荧光寿命

中图分类号：Q51" " " " " " " " " "文献标识码：A

0" " 引言

荧光蛋白的出现，使人类在细胞和亚细胞分辨率下实时原位观测活细胞内多种生理和病理过程的科学夙愿成为现实，极大地促进了生物科学和医药科学的研究与发展。源自于维多利亚多管水母（Aequorea Victoria）的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是第一个被分离纯化的荧光蛋白［1］。该生物发光蛋白质是由238个氨基酸组成的单体蛋白，由11段β-折叠及部分α-螺旋组成β-桶状结构［2］。蛋白分子量约为27 kDa，发色团被包裹在桶状结构中心，由三肽S65-Y66-G67自发环化和氧化产生［3］。随着定点突变和随机突变技术的发展，基于GFP蛋白的不同突变型荧光蛋白也得到发展，包括蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）以及超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）等。另外，随着具有类似三维空间结构的珊瑚类荧光蛋白被发现，具有更长波长的橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白和远红外荧光蛋白很好地补充了GFP蛋白的发射谱，使荧光蛋白的发射谱覆盖420～655 nm。基于荧光蛋白具有稳定性好、灵敏度高、细胞毒性低及可基因编码等优点，其在分子标记、药物筛选、基因表达调控研究、生物大分子相互作用研究和生物传感器等方面得到广泛应用［4］。

生物传感器是荧光蛋白的一项重要应用，通过将信号分子感应结构域与荧光蛋白偶联构筑而成，将感应结构域对信号分子响应引起的构象变化转变为荧光蛋白光谱信号的变化，从而实现对信号分子的检测。经过基因编码的荧光蛋白探针实现了对生命体内pH［5-6］、金属离子［7-9］、无机盐、氧化物和超氧化物［10-12］等多种信号分子位置信息和浓度信息的动态监测，但是，由于融合的感应结构域自然末端远离荧光蛋白发色团相对灵活的区域，阻碍了感应结构域与荧光蛋白的有效构象耦合，使经过基因编码的荧光蛋白探针的检测限和灵敏度受限，显著阻碍了其发展。循环排列的荧光蛋白是在原始荧光蛋白的基础上通过结构重构获得，其重构原理是将原始荧光蛋白发色团附近的合适位点劈开，并将原始蛋白的N端和C端通过肽链连接，从而使重构后的荧光蛋白发色团附近产生新的N端和C端，用于与感应结构域偶联。独特的构筑方式使循环排列荧光蛋白的发色团更加接近感应结构域末端，使感应结构域与荧光蛋白有效构象耦合而产生较高灵敏度和较宽动态范围，在生物分子检测方面表现出优异的性能。

近年来，循环排列荧光蛋白探针引起越来越多科学家的注意，逐渐发展成为一类重要的荧光蛋白探针，其中具有代表性的是基因编码钙指示剂（GECIs）［13-15］。GECIs可以靶向定位到特定的细胞类型和亚细胞组织，并广泛应用于神经活动的成像研究。其中，Chen等［16］研发的高灵敏度GCaMP6和jGCaMP7探针，能够可靠地检测到神经元体的单一动作电位和单个树突棘的定向调谐突触钙瞬态。GCaMP6探针是由高亮度的循环排列绿色荧光蛋白（cpGFP）与钙离子感应结构域即钙调蛋白CaM和相互作用的结合肽M13偶联构筑而成。CaM-M13偶联在cpGFP的β-桶上的新末端，靠近β-桶内的发射团。当CaM-M13复合物与Ca2+结合后，其构象的变化将调节β-桶内溶剂的进入以及发色团的解离常数，从而使荧光强度随着Ca2+的结合而增加。jGCaMP7探针是GCaMP6通过广泛的定向进化获得，在保持GCaMP6基本结构的基础上，将M13肽替换为CBP肽。通过广泛的定向进化得到的荧光蛋白探针，在灵敏度、动力学响应和线性检测范围等性能方面可与合成的有机钙染料相媲美［17］，但是，大多数荧光蛋白探针由于受到循环排列荧光蛋白（cpFP）自身缺陷的限制，如荧光亮度低、易受环境pH影响和光漂白现象严重等，使其在复杂生物体环境内的应用受到限制。因此，提高和改善cpFP的光学活性及物理性能具有重要意义。

研究表明［18-19］，即使对结构类似的荧光蛋白进行结构重建得到的cpFP，其许多特性也有显著的不同，因此开发更多类型的cpFP将加快此类探针的构建和性能优化。基于此，本研究以具有优异荧光强度的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为母体，在144位和149位氨基酸残基断开母体，通过短肽GGTGGS连接原始N端和C端，构建了循环排列的EGFP（简称cpEGFP），并利用分子克隆技术成功构建了其原核生物的表达载体，进一步通过对诱导表达条件的摸索获得其最优表达的温度、时间和诱导剂浓度。基于最优条件表达的cpEGFP通过快速蛋白质纯化技术获得具有稳定荧光的cpEGFP蛋白质样品，并用于其光学性能表征。与sfGFP对比分析发现，循环排列后的cpEGFP，其最大激发波长和发射波长红移、荧光强度和量子产率降低，但质子化、非质子化以及平均荧光寿命均有所增加。cpEGFP的成功构建和性能表征为其后续性能优化及在荧光蛋白探针中的应用奠定了研究基础。

1" " 实验材料和方法

1.1" "实验仪器和试剂

本实验所用仪器主要包括PCR仪（德国耶拿）、荧光分光光度计（日本岛津，RF-6000）、紫外-可见光分光光度计（日本岛津，UV-2600）、超微量紫外-可见分光光度计（杭州米欧仪器，ND-100C）及高灵敏度稳瞬态荧光光谱仪（日本堀场，QuantaMaster 8000）。

本实验所用的质粒小提试剂盒及胶回收试剂盒购自Omega Bio-Tek公司和酶购自宝日医生物技术（北京）有限公司，Escherichia coli DH5α和Escherichia coli BL21菌株为实验室自制并于液氮中保存，其他试剂均为分析纯且购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2" "pET28α-cpEGFP表达载体的构建

本实验通过分子克隆技术，将目的基因片段cpEGFP插入载体pET28α中，构建目的蛋白N端含有6×His标签的重组质粒，具体过程为：以全基因合成cpEGFP作为模板进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增后的产物，对目的条带进行切胶回收。利用限制性内切酶对载体质粒pET28α和目的片段cpEGFP进行酶切，用T4 DNA连接酶将目的片段与载体质粒pET28α酶切产生的黏性末端连接后，通过化学法转化至E. coli DH5α的感受态菌株中。通过PCR鉴定和酶切鉴定进行初步筛选及验证，对验证成功的表达载体进行测序，测序正确的重组质粒pET28α-cpEGFP转化至E. coli BL21的感受态菌株，进行诱导表达。

1.3" "cpEGFP诱导表达条件的筛选

将新鲜划线的单克隆菌株接种至含有卡那霉素（30 μg/mL）的液体LB培养基中，在恒温37 ℃转速225 r/min的摇床中培养12～16 h。培养的菌液按照1∶100的体积扩大培养至菌密度值（OD600）为0.5～0.6，加入浓度为0.25 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。加入诱导剂后，分别选择16 ℃诱导12 h、25 ℃诱导10 h、30 ℃诱导6 h、37℃诱导4 h，并在诱导期间分别取样，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对目的蛋白的表达进行鉴定，采用ImajeJ处理凝胶图像。同时，诱导完成的菌液使用高速离心（9 500 r/min，6 min）的方式收集，菌饼用10 mmol/L的PBS缓冲液洗涤2次后重悬，调节菌密度值为1，通过超微量紫外荧光分光光度计测定其荧光值。在上述条件下对每个实验样品进行3次重复荧光测定。

1.4" "Ni-NTA金属螯合层析柱对目的蛋白的纯化

选择最优条件诱导表达目的蛋白，离心（9 500 r/min，6 min）收集菌体，使用10 mmol/L的PBS缓冲液洗涤2次。在10 mL超声裂解液（10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4；200 mmol/L NaCl；25 mmol/L咪唑；体积浓度5%的甘油；5 mmol/L β-巯基乙醇）中超声破碎细菌30 min（超声5 s，停顿5 s）。超声破碎后离心，取上清液使用0.22 μm的滤膜过滤，上样至Ni-NTA金属螯合层析柱。用体积浓度10％的咪唑洗脱液（50 mmol/L咪唑；10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4；200 mmol/L NaCl；5 mmol/L β-巯基乙醇）去除杂蛋白后，用体积浓度40％的咪唑洗脱液（200 mmol/L咪唑；10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4；200 mmol/L NaCl；5 mmol/L β-巯基乙醇）洗脱目的蛋白。洗脱后的蛋白用HRV3C蛋白酶低温过夜酶切，再经Ni-NTA柱在缓冲溶液（10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4；200 mmol/L NaCl；5 mmol/L β-巯基乙醇）中洗脱酶切的6×His标签。纯化的蛋白通过脱盐柱洗脱去除蛋白溶液中残留咪唑及β-巯基乙醇，置换到蛋白储存液（10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4；200 mmol/L NaCl；0.5 mmol/L TCEP）中备用。

1.5" "荧光蛋白基本参数的表征

纯化好的蛋白通过紫外-可见分光光度计扫描荧光蛋白的紫外光谱，并利用朗伯-比尔定律和特征吸收峰（278 nm）处的摩尔吸收系数计算浓度。将蛋白稀释至浓度为1 μmol/L进行荧光蛋白激发光谱和发射光谱扫描，以紫外吸收峰波长作为激发光波长，扫描荧光蛋白的发射光谱，得到最佳发射波长；反扫得到激发光谱，从而确定最佳激发波长。测试过程中的激发和发射狭缝宽度均为10 nm。在上述条件下对每个实验样品进行3次重复测定。

量子产率通过比较法测定，标准品选用荧光素钠水溶液，用去离子水将荧光蛋白及荧光素钠稀释至荧光蛋白最佳激发光波长493 nm下的紫外可见吸光度值低于0.05，扫描500～590 nm的荧光光谱，激发和发射狭缝宽度均为10 nm，对荧光峰面积进行积分，由式（1）计算荧光量子产率。在上述条件下对每个实验样品进行3次重复测定。

式中：QS、FS和AS分别表示参比标准物质的荧光量子产率、积分荧光强度和吸光度；QY、FY和AY分别表示待测物质的荧光量子产率、积分荧光强度和吸光度。

荧光寿命的测定以纯牛奶做散射基质，发射波长513 nm和511 nm下扫描曲线，双指数拟合，由式（2）计算荧光蛋白的荧光寿命。在上述条件下对每个实验样品进行3次重复测定。实验中所有数据图像均使用Origin 2021处理。

式中：τ为蛋白荧光衰减时间；b为归一化指数前因子。

2" 实验结果和讨论

2.1" "cpEGFP的设计和表达载体的构建

现有文献研究结果表明，利用短肽连接母体蛋白的N端和C端构建得到的cpFP能维持稳定的桶状结构，对母体蛋白的三级结构影响很小［20］。在对生物传感器的研究中，多数是将感应结构域插入GFP氨基酸145位或148位之后，位于β-桶的侧面，该位置可以很好地耐受感应结构域的插入［21-23］。因此，本研究中通过敲除EGFP的145～148位氨基酸，在144及149位形成新的N端和C端，同时暴露位于β-桶内的发色团，再利用短肽GGTGGS连接原始荧光蛋白sfGFP的N端和C端，得到循环排列的增强型绿色荧光蛋白cpEGFP，如图1所示。

采用酶切连接的克隆方式对表达载体进行构建。由图1可知，扩增产物在750 bp附近有明显的单条带，与基因片段cpEGFP理论值（723 bp）相符，初步判定目的条带PCR扩增正确。酶切后pET28a载体与目的基因在5 000 bp以上及750 bp附近有明显的单一条带，与线性pET28α理论值（5 290 bp）及目的片段cpEGFP理论值（723 bp）相符。连接转化后的PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析结果显示，表达载体pET28α-cpEGFP构建成功。

2.2" "诱导条件的筛选

为了探究温度和时间对cpEGFP蛋白表达量及荧光特性的影响，选取不同诱导温度和时间的菌液进行SDS-PAGE分析，如图2所示。0 h条件下，荧光蛋白cpEGFP在理论值（分子量为26.97 kDa）附近没有表达，经IPTG诱导后在理论值附近的表达量明显增加，可以确定目的基因成功表达。根据ImageJ分析，cpEGFP在25 ℃、30 ℃和37 ℃条件下表达高效，蛋白表达量随时间逐渐增加，直至饱和；但在16 ℃诱导12 h条件下表达缓慢且时间过长，最大表达量仅为25 ℃下的30％，不能作为最佳诱导温度条件。在上述条件表达完成的基础上，测定相同菌密度下菌体的荧光值，如图3所示。随着温度降低，菌体的荧光强度逐渐增加，在25 ℃诱导10 h条件下，菌体的荧光强度最高，分别为37 ℃的3.5倍、30 ℃的2.0倍和16 ℃的1.7倍。由此可知，低温对cpEGFP的荧光特性更有利，其在25 ℃诱导10 h下表达稳定高效，故选择25 ℃作为最优的诱导条件。

2.3" "荧光蛋白的纯化

利用Ni-NTA柱对目的蛋白进行纯化，对纯化过程的每个环节分别取样，通过SDS-PAGE对纯化过程中的目的蛋白进行鉴定，如图4所示。超声破碎后，目的蛋白存在于上清液中，约占总蛋白量的21％，故循环排列后蛋白折叠效率高、水溶性较好。通过咪唑进行竞争性洗脱后，杂蛋白的剔除效率很高，得到的目的蛋白纯度可达80％（质量分数），与理论值相符。N端含有6×His标签荧光蛋白的cpEGFP在通过HRV3C酶切后，去除6×His标签的效率较高，条带位置明显降低，且纯度不发生明显变化。最后脱盐后得到的荧光蛋白cpEGFP纯度可达80％（质量分数）。

2.4" "光谱表征

为了比较荧光蛋白的基本性能，对cpEGFP和sfGFP从荧光特性、稳定性、表达效率以及应用选择等方面进行综合考量。鉴于sfGFP具有出色的稳定性、折叠能力和改善的荧光特性等特点，在分子生物学和细胞生物学的研究中扮演着重要角色，并且与cpEGFP在光学性能方面的差异较小，所以选择sfGFP作为母体蛋白进行对比。通过荧光光谱分析发现，与sfGFP相比，cpEGFP发色团的激发和发射波长均出现红移，如图5所示。其中，cpEGFP的最佳激发波长与sfGFP相比红移了5 nm，而发射波长则红移了2 nm。这种波长的变化可能是由于循环排列导致发色团附近的氨基酸环境发生变化。在cpEGFP中，如果发色团附近的Y145氨基酸被敲除，会导致发色团附近氢键的相互作用发生改变，电子密度重排，进而影响分子的能级结构，从而导致激发波长和发射波长变化。

2.5" "性能对比

基于光致发光的物质，物质本身的荧光量子产率和荧光亮度是基本物理量，是评价样品发光效率和确定其光物理机制的重要参数。cpEGFP的荧光强度仅为sfGFP的5％，量子产率比sfGFP降低约25％，如图6所示。循环排列后，虽然cpEGFP的荧光蛋白仍能维持三维桶状结构，但发色团的局部微环境发生改变，其中最主要的是，发色团附近具有特定相互作用的氨基酸残基如E125和Y143，改变了发色团的局部电荷分布，影响了荧光分子的光物理特征，进而影响了荧光发射效率。

荧光蛋白cpEGFP和sfGFP的荧光寿命表征如图7所示，荧光寿命拟合数据如表1所示。循环排列荧光蛋白cpEGFP在513 nm 处的荧光发射呈现双指数衰减，质子化的生色团具有相对较长的荧光寿命τ1=（1.54±0.01）ns，去质子化的发色团荧光寿命为τ2=（4.61±0.01）ns，平均寿命为（2.50±0.01）ns。sfGFP在511 nm处，质子化的生色团荧光寿命为τ1=（1.38±0.01）ns，去质子化的发色团荧光寿命为τ2=（4.13±0.02）ns，平均寿命为（2.30±0.01）ns。以上数据表明，循环排列后荧光蛋白的荧光寿命增加，长寿命下的荧光蛋白具有较高的发光效率，可以长时间、稳定地发射荧光，这印证了已有研究结果［24-25］。故可推测，循环排列后的荧光蛋白具有更好的光稳定性，而产生的原因是cpFP虽然仍能维持荧光蛋白稳定的桶状结构，但对于sfGFP来说，发色团的位置处于相对孤立状态，减少了与邻近基团的相互作用，这有助于抑制非辐射能量损耗，使荧光基团更倾向于辐射发光，延长荧光寿命。

3" " 结论

本研究利用短肽连接EGFP的自然末端，并在144和149位裂开得到全新的N端和C端，从而构建了能够维持三维桶状结构的循环排列荧光蛋白cpEGFP。诱导表达条件分析表明，表达温度是cpEGFP蛋白表达效率和荧光强度的重要影响因素。对比实验结果发现，cpEGFP在25 ℃显示出较高的表达效率和荧光强度，这可能是由于低温环境有效改变了蛋白质的折叠效率和发色团的成熟速度。通过sfGFP和cpEGFP的基本光谱参数表征和对比分析发现，cpEGFP的荧光强度仅为sfGFP的5％，量子产率为sfGFP的75％。在荧光寿命参数方面显示出长寿命的趋势，主要原因是循环排列后导致其发色团及与周边氨基酸的相互作用和电子环境改变，发色团处于在相对独立的环境中。研究结果为更多cpFP的构建提供了参考，同时为该类蛋白的性能优化及其在生物学中的应用奠定了基础。

参考文献：

［1］ SHIMOMURA O，JOHNSON F H，SAIGA Y. Extraction，purification and properties of aequorin， a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，Aequorea［J］. Journal of cellular and comparative physiology，1962，59（3）：223-239.

［2］ ORMÖM，CUBITT A B，KALLIO K，et al. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein［J］. Science，1996，273（5280）：1392-1395.

［3］ HEIM R，PRASHER D C，TSIEN R Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein［J］. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，1994，91（26）：12501-12504.

［4］ KOSTYUK A I，DEMIDOVICH A D，KOTOVA D A，et al. Circularly permuted fluorescent protein-based indicators：history，principles，and classification［J］. International journal of molecular sciences，2019，20（17）：4200-4237.

［5］ YU H J，CHEN C，CAO X D，et al. Ratiometric fluorescent pH nanoprobes based on in situ assembling of fluorescence resonance energy transfer between fluorescent proteins［J］. Analytical and bioanalytical chemistry，2017，409（21）：5073-5080.

［6］ EGUCHI Y，FUKUMORI Y，TAOKA A. Measuring magnetosomal pH of the magnetotactic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1 using pH-sensitive fluorescent proteins［J］. Bioscience，biotechnology，and biochemistry，2018，82（7）：1243-1251.

［7］ JIANG T，GUO D P，WANG Q，et al. Developing a genetically encoded green fluorescent protein mutant for sensitive light-up fluorescent sensing and cellular imaging of Hg（II）［J］. Analytica chimica acta，2015，876（30）：77-82.

［8］ WANG D，WEI L D，TAN J X，et al. A novel strategy of engineering genetically encoded probe for ultrasensitive sensing Hg2+ with unusual planar trigonometric coordination configuration［J］. Anal chimica acta，2023，1252：341049-341057.

［9］ DISCHLER A M，MASLAR D，ZHANG C，et al. Development and characterization of a red fluorescent protein-based sensor RZnP1 for the detection of cytosolic Zn2+［J］. ACS sensors，2022，7（12）：3838-3845.

［10］ KULDYUSHEV N，SCHÖNHERR R，COBURGER I，et al. A GFP-based ratiometric sensor for cellular methionine oxidation［J］. Talanta，2022，243（1）：123332.

［11］ ROMA L P，DEPONTE M，RIEMER J，et al. Mechanisms and applications of redox-sensitive green fluorescent protein-based hydrogen peroxide probes［J］. Antioxidants amp; redox signaling，2018，29（6）：552-568.

［12］ PIATTONI C V，SARDI F，KLEIN F，et al. New red-shifted fluorescent biosensor for monitoring intracellular redox changes［J］. Free radical biology and medicine，2019，134（14）：545-554.

［13］ ZHANG Y，RÓZSA M，LIANG Y J，et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations［J］. Nature，2023，615（7954）：884-891.

［14］ AKERBOOM J，RIVERA J D V，GUILBE M M R，et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design［J］. Journal of biological chemistry，2009，284（10）：6455-6464.

［15］ QIAN Y，RANCIC V，WU J H，et al. A bioluminescent Ca2+ indicator based on a topological variant of GCaMP6s［J］. Chembiochem，2019，20（4）：516-520.

［16］ CHEN T W，WARDILL T J，SUN Y，et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity［J］. Nature，2013，499（7458）：295-300.

［17］ DANA H，SUN Y，MOHAR B，et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments［J］. Nature methods，2019，16（7）：649-657.

［18］ WU T C，PANG Y，AI H W. Circularly permuted far-red fluorescent proteins［J］. Biosensors， 2021，11（11）：438-453.

［19］ CARLSON H J，COTTON D W，CAMPBELL R E. Circularly permuted monomeric red fluorescent proteins with new termini in the β-sheet［J］. Protein science，2010，19（8）：1490-1499.

［20］ TOPELL S，HENNECKE J，GLOCKSHUBER R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein［J］. FEBS letters，1999，457（2）：283-289.

［21］ ABEDI M R，CAPONIGRO G，KAMB A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides［J］. Nucleic acids research，1998，26（2）：623-630.

［22］ BAIRD G S，ZACHARIAS D A，TSIEN R Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins［J］. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，1999，96（20）：11241-11246.

［23］ WU T C，KUMAR M，ZHANG J，et al. A genetically encoded far-red fluorescent indicator for imaging synaptically released Zn2+［J］. Science advances，2023，9（9）：eadd2058.

［24］ MERZLYAK E M，GOEDHART J，SHCHERBO D，et al. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime［J］. Nature methods，2007，4（7）：555-557.

［25］ SARKISYAN K S，GORYASHCHENKO A S，LIDSKY P V，et al. Green fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime［J］. Biophysical journal，2015，109（2）：380-389.

［责任编辑：许春慧］

收稿日期：2024-06-28

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目“基因编码荧光探针构筑新策略及在重金属胁迫的细胞中毒及解毒机制探究中的应用”（22267015）；广西自然科学基金面上项目“重金属胁迫的细胞毒理机制研究工具开发及应用的基础研究”（2022JJA120115）

通信作者：王丹，博士，南宁师范大学副教授，电子邮箱为wangdan1989323@126.com。