肺炎克雷伯菌肝脓肿小鼠模型的建立

摘要：为构建稳定可靠的肺炎克雷伯菌肝脓肿（KPLA）动物模型，选取18 g左右健康ICR小鼠，以高毒力动物源肺炎克雷伯菌临床分离株KP001为造模菌株，分别从接种方式（灌胃、滴鼻和腹腔注射，接种菌数为1×107 CFU）和接种剂量进行摸索，并对造模成功小鼠的血清样品进行谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、白蛋白、乳酸脱氢酶、总胆红素等生化指标的测定。结果表明：灌胃小鼠存活率100%，但肝脏未出现脓肿；滴鼻小鼠死亡率100%，肺脏病变明显，40%死亡小鼠肝脏出现脓肿；腹腔注射1×106 CFU细菌后，小鼠存活率为75%以上，且存活小鼠肝脏均出现脓肿，成模率100%。病理切片显示造模成功小鼠肝细胞排列紊乱，中央静脉周围有大量炎性细胞浸润。生化指标检测显示，与对照小鼠相比，造模成功小鼠的血清样品中γ-谷氨酰转移酶极显著升高（P＜0.01），碱性磷酸酶极显著下降（P＜0.01），谷丙转氨酶、白蛋白显著下降（P＜0.05）。综上分析表明，通过腹腔注射方式，接种1×106 CFU KP001菌株后可成功构建KPLA小鼠模型，γ-谷氨酰转移酶和碱性磷酸酶等生化指标可用于评估模型建立效果。

关键词：肺炎克雷伯菌；肝脓肿；动物模型；生化指标

中图分类号：S575.4文献标志码：A文章编号：0253−2301（2024）10−0029−07

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.10.005

陈紫怡，路佳臻，万兆丰，等.肺炎克雷伯菌肝脓肿小鼠模型的建立[J].福建农业科技，2024，55（10）：29−35.

Establishment of the Mouse Model of Klebsiella pneumoniae Liver Abscess

CHEN Zi-yi1，LU Jia-zhen1，2，WAN Zhao-feng1，WEN Hui-ya1，2，WEI Jing-yun1，ZHANG Xin-yi1，ZENG Xu-jian1，HUANG Cui-qin1，3＊，BAO Yin-li1，3*

（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan，Fujian 364012，China;2.College of Animal Science，FujianAgriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China;3.Fujian University Engineering Research Centerfor the Prevention and Control of Animal Original Zoonosis，Longyan，Fujian 364012，China）

Abstract：In order to construct a stable and reliable animal model of Klebsiella pneumoniae liver abscess（KPLA），about 18 g healthy ICR mice were selected，and the highly virulent animal-derived Klebsiella pneumoniae clinical isolated strain KP001 was used as the model strain.Then，the inoculation methods（including the gastric irrigation，nasal drip and intraperitoneal injection，with the number of inoculated bacteria was 1×107 CFU）and the inoculation dosage were explored.The biochemical indexes of serum samples from the mice with successful modeling were determined，including the alanine aminotransferase，aspartate aminotransferase，alkaline phosphatase，γ-glutamyl transferase，albumin，lactate dehydrogenase，and total bilirubin.The results showed that the survival rate of mice treated with gastric irrigation was 100%，but there was no abscess in the liver.The mortality rate of mice treated with nasal dripping was 100%，with obvious lung lesions，and the liver abscess occurred in 40%of the dead mice.After the intraperitoneal injection of 1×106 CFU bacteria，the survival rate of mice was more than 75%，and the liver abscesses appeared in the surviving mice，with the modeling rate of 100%.The pathological sections showed that the liver cells of the successfully modeled mice arranged in disorder，and a large number of inflammatory cells infiltrated around the central vein.The detection of biochemical indicators showed that compared with the control mice，theγ-glutamyl transferase in the serum samples of the successfully modeled mice was significantly increased（P＜0.01），the alkaline phosphatase was significantly decreased（P＜0.01），and the alanine aminotransferase and albumin were significantly decreased（P＜0.05）.In conclusion，the analysis showed that the KPLA mouse model could be successfully construct-ed by the intraperitoneal injection of 1×106 CFU KP001 strain.The biochemical indexes such asγ-glutamyl transferase and alkaline phosphatase could be used to evaluate the effect of model establishment.

Key words：Klebsiella pneumoniae；Liver abscess；Animal model；Biochemical indicators

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一种重要的人畜共患条件致病菌，属于肠杆菌科克雷伯菌属。通常情况下，这种菌在健康人和动物的呼吸道和肠道中存在而不具致病性，然而，当宿主免疫功能减弱、身体虚弱或长期使用抗生素时，其可转变为致病菌，引发人和动物发病[1]。20世纪80年代，高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP）在我国台湾地区被首次报道，随后亚洲、欧洲、北美等多个国家和地区相继报道[2−3]。与经典型肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella pneumonia，cKP）相比，hvKP具有更强的致病性、侵袭力和转移性，并可导致原发性肝脓肿[3]。

肝脓肿（Liver abscess，LA）是由病原体侵入肝脏而引起的一种严重的化脓性疾病。导致肝脓肿发生的病原体较多，包括细菌、阿米巴、真菌、寄生虫等，其中细菌占比最高，达80%[4]。目前，KP已经超过大肠杆菌成为独立导致肝脓肿的首要病原菌[5−6]。数据显示，在从肝脓肿感染者分离的病原菌中，KP约占50%[5−6]。此外，KP导致的肝脓肿（Klebsiella pneumoniae liver abscess，KPLA）具有一定的迁移性。HvKP可以从肝脏迁移至其他脏器或组织，引发感染，如肺、胸膜、前列腺、骨、关节、肾脏、脾脏、肌肉、筋膜、软组织、皮肤、眼睛以及中枢神经系统等，在临床防治中难度更大[7]。

目前，KPLA的发病机制仍未阐释清楚，限制了新的防治技术的开发，降低了从源头遏制疾病发生的可能性。缺乏稳定的、便于操作和获得的KPLA动物模型在一定程度上影响了相关工作的开展。因此，本研究以1株动物源hvKP临床分离株为造模菌株，通过接种方式和接种剂量的摸索，建立稳定的KPLA小鼠模型，并进一步测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶等多个肝功能相关生化指标，以期为研究KPLA发病机制提供良好的动物模型，并便于评估模型建立效果。

1材料与方法

1.1菌株和试验动物

本研究所用菌株KP001为hvKP，由兽医公共卫生研究室分离和保存。18 g左右SPF级健康ICR小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，试验中按组饲养于洁净动物房中，并每日给予洁净饮用水和饲料。

1.2主要试剂

酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司；琼脂粉、革兰氏染色试剂盒购自青岛海博生物技术有限公司；氯化钠、PBS缓冲液、琼脂糖、无菌无酶ddH2O购自上海生工生物工程股份有限公司；4%多聚甲醛购自武汉赛维尔生物科技有限公司；碱性磷酸酶测试盒、谷草转氨酶测试盒、谷丙转氨酶测试盒、乳酸脱氢酶测试盒、γ-谷氨酰转移酶测试盒、总胆红素测试盒、白蛋白测试盒、总蛋白定量测定（BCA法）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司；PCR Mix和核酸染料购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3菌株复苏及培养

以三区划线法，将菌株KP001甘油冻存菌转接至LB固体培养基上，37℃倒置培养18 h。次日取出，挑取典型单菌落转接至LB试管中，37℃、180 r·min−1过夜培养，4℃保存备用。

1.4动物模型的建立

1.4.1接种方式的摸索按照1：100的比例将过夜培养的菌株KP001转接至LB试管中，37℃、180 r·min−1培养至OD600≈1.0。4℃、5 000 r·min−1离心富集菌体，用无菌PBS缓冲液清洗菌体3遍，并调整菌数至5×107 CFU·mL−1。将30只健康ICR小鼠随机分成6组，每组5只，分别标记为A1～A6。其中A1～A3组分别以灌胃、滴鼻和腹腔注射的方式接种0.2 mL菌液，A4～A6组分别以相应的方式接种等量PBS缓冲液。接种后0～7 d内定时观察小鼠临床症状及存活情况。期间死亡小鼠立即剖检，并观察组织病变。存活小鼠于观察期结束后采用颈椎脱臼法处死，并剖检观察肝脏是否出现脓肿。

1.4.2接种剂量的摸索参照1.4.1培养菌株KP001并富集菌体，调整菌数分别至5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103 CFU·mL−1。将56只健康ICR小鼠随机分为7组，每组8只，分别标记为B1～B7。其中，B1～B6组以腹腔注射的方式接种0.2 mL菌液，接种菌数分别为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103 CFU；B7组作为对照组，以腹腔注射的方式接种等体积PBS缓冲液。参照1.4.1方法观察小鼠。

1.4.3肝脓肿模型的建立参照1.4.1培养菌株KP001并富集菌体，调整菌数至5×106 CFU·mL−1。选择13只健康ICR小鼠，随机分成2组，分别标记为KP感染致肝脓肿组（KPLA组）和对照组（CON组）。其中KPLA组8只小鼠，腹腔接种0.2 mL菌液；CON组5只小鼠，腹腔接种0.2 mL PBS。接种后0～7d内定时观察小鼠临床症状及存活情况。存活小鼠通过眼球摘除法采集血液，并将全血于25℃孵育2 h后置于4℃过夜，次日吸取血清至1.5 mL EP管中，−80℃保存。随后采用颈椎脱臼法处死小鼠，剖检并肉眼观察肝脏有无脓肿形成以及脓肿大小、分布等情况。取肝脏固定于4%多聚甲醛，送至杭州厚爱生物科技有限公司进行标本包埋、石蜡切片和HE染色。

1.5肝脓肿小鼠病原菌的鉴定

用无菌一次性接种环蘸取肝脏脓肿部位，三区划线法接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养18 h后，挑取代表性单菌落进行革兰氏染色镜检及KP特异性鉴定PCR。引物序列为F：5'-TGAT TGCATTCGCCACTGG-3'；R：5'-GGTCAACCCAAC GATCCTG-3'，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成[7]。反应体系为2×PCR Mix 12.5μL、上下游引物各1μL、ddH2O 10.5μL，蘸取菌落与PCR反应液混合。反应程序为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后于紫外凝胶成像系统仪观察。

1.6肝功能相关生化指标的测定

参照试剂盒说明书，对KPLA组和CON组中存活小鼠血清样品进行谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、白蛋白、乳酸脱氢酶、总胆红素等生化指标的测定。

1.7数据统计

采用GraphPad Prism 8.0进行数据统计，两组间数据差异性分析采用两独立样本t检验进行。

2结果与分析

2.1小鼠肝脓肿模型接种方式的摸索

分别采用灌胃（A1组）、滴鼻（A2组）和腹腔注射（A3组）3种方式接种小鼠，接种菌数为1×107 CFU；对照组（A4～A6组）分别以相同方式接种等体积PBS缓冲液。接种后观察7 d，结果显示A1组和A4～A6组小鼠均未发生死亡，剖检未见明显病理变化，肺脏正常（图1A、1B），肝脏未出现脓肿（图1E、1F）。A2组在接种后4 d内小鼠全部死亡，剖检可见肺脏严重肿胀、淤血（图1C），其中2只小鼠肝脏边缘可见轻微脓肿（图1G）。A3组小鼠存活2只，剖检肝脏可见明显脓肿（图1H），肺脏无明显变化（图1D）；死亡小鼠剖检可见肺脏淤血、肿胀，肝脏无脓肿。脓肿部位细菌分离鉴定见图2A，菌体为两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌，呈单个或成对排列；KP特异性鉴定PCR结果（图2B）显示，挑取的多个单菌落在428 bp处扩增出与预期大小一致的目的条带，证实该脓肿是由KP感染导致的。因此，后续试验选择腹腔注射方法用于肝脓肿模型的建立。

2.2小鼠肝脓肿模型接种剂量的摸索

采用腹腔注射方法，B1～B6组分别接种1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103 CFU细菌，B7组接种等体积PBS。接种后观察7 d，由图3可知，B6组和B7组未发生小鼠死亡；B1组小鼠死亡6只，存活率为25%；B2组小鼠死亡5只小鼠，存活率为37.5%；B3组小鼠死亡2只，存活率为75%；B4、B5组小鼠各死亡1只，存活率均为87.5%；说明小鼠存活率与接种菌数呈负相关。存活小鼠剖检可见，B1、B2、B3组小鼠肝脏均出现脓肿，B4组存活的7只小鼠中3只小鼠肝脏出现脓肿，B5、B6组存活小鼠肝脏未出现脓肿，说明肝脓肿出现的概率与接种菌数呈正相关。因此，后续试验选择接种剂量为1×106 CFU。

2.3小鼠肝脓肿模型的建立

以最佳接种剂量（1×106 CFU）腹腔注射8只小鼠（KPLA组），并观察7 d。结果显示，1只小鼠死亡，存活7只小鼠剖检可见肝脏出现脓肿，但不同小鼠之间脓肿部位和大小存在差异。5只对照小鼠（CON组）全部健活，剖检肝脏正常，未见肉眼可见的病理变化。

2.4小鼠肝脏组织切片观察

由图4可知，CON组小鼠肝脏组织结构紧密，肝小叶紧凑有序，肝细胞形态正常，中央静脉周围无炎性细胞（图4A）；KPLA组小鼠在腹腔注射1×106 CFU细菌7 d后，肝脏出现脓肿，肝细胞排列紊乱，少量肝细胞坏死溶解，大量炎性细胞浸润，尤其是在中央静脉周围（图4B）。

2.5小鼠肝功能相关生化指标的测定

分别对KPLA组和CON组小鼠血清样品进行谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、白蛋白、乳酸脱氢酶、总胆红素的测定。由图5可知，与CON组相比，接种1×106 CFU细菌7 d后，KPLA组小鼠血清样品中γ-谷氨酰转移酶极显著升高（P＜0.01），碱性磷酸酶极显著下降（P＜0.01），谷丙转氨酶、白蛋白显著下降（P＜0.05），谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和总胆红素差异不显著（P＞0.05）。

Fig.5 Measurement of liver function-related biochemical indicatorsin KPLA model mice

3讨论与结论

动物模型的建立对研究KPLA的发病机制、防治效果的评价具有重要的意义。本试验以健康ICR小鼠为研究对象，通过腹腔注射1×106 CFU hvKP菌株KP001，成功构建了KPLA小鼠模型，为hvKP致病机理研究和疗效评价奠定了基础。

试验动物、病原微生物以及造模方式是动物模型构建的三大主要因素。以往的研究中，KPLA动物模型常采用免疫力缺陷小鼠进行，如在糖尿病小鼠基础上灌胃KP菌株等，但存在“造模成功率低”“无法排除高糖干扰”等问题[8]。本试验以免疫力正常的健康小鼠为对象，成功构建了KPLA模型，小鼠存活率75%以上，存活小鼠脓肿成模率为100%。在健康小鼠中成功造模，这可能与优质的菌株密切相关。大量研究表明，引起肝脓肿的KP大多为hvKP[9]。本研究所用KP001菌株分离自1例急性死亡华南虎幼虎的肺脏细支气管。前期试验发现，其具有较强的致病力，LD50为3.21×106 CFU，并携带黏液表型调节基因A（rmpA）、铁载体相关毒力基因（iroB、aerobactin、iucA）、假定转运蛋白编码基因（peg344）等与hvKP高度相关的毒力基因。这些毒力基因的存在，可以帮助细菌抵抗宿主补体系统介导的杀菌作用，竞争组织血液中的铁，并通过生成催化羟基自由基发挥抗氧化作用，从而增强菌株毒力，加重菌株对宿主组织的损伤[10−12]。此外，正确的造模方式也是关键因素。KP研究中常通过鼻腔注射、气溶胶感染、尾静脉注射等方法构建基于呼吸道感染模型，并进一步用于KP的评价[13−14]。但这些模型无法适用于KPLA的研究。本研究摸索了灌胃、滴鼻和腹腔注射3种方法，结果显示灌胃小鼠存活率最高，但无法产生肝脓肿；滴鼻小鼠死亡率最高，肺脏病变明显，少量小鼠可产生肝脓肿，成模率低；腹腔注射小鼠在接种适量菌液后，存活率较高，大部分存活小鼠可产生肝脓肿，成模率高。

肝脓肿具有隐匿性。KPLA模型在临床使用时，无法通过临床症状来判定模型建立是否成功。为了便于模型建立效果的评价，本研究在病理剖检确认肝脓肿产生的情况下，进一步测定和比对了血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、白蛋白、乳酸脱氢酶和总胆红素等肝脏相关生化指标，结果显示，KP感染并产生肝脓肿小鼠血清样品中γ-谷氨酰转移酶极显著升高（P＜0.01），碱性磷酸酶极显著下降（P＜0.01），谷丙转氨酶、白蛋白显著下降（P＜0.05）。这些指标的变化，将有助于在不进行动物剖检的情况下评估KPLA小鼠模型是否成功建立。郑亚虹等利用人源K1血清型hvKP菌株建立了基于C57BL/6J小鼠的肝脓肿模型，造模小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶均明显升高[15]。这与本试验的检测结果存在差异，可能是由于不同的菌株和小鼠品系所造成的，同时也提示不同种hvKP菌株导致的KPLA可能在生化指标上存在差异。

综上所述，本研究建立了基于hvKP菌株的腹腔接种KPLA小鼠模型，最佳接种剂量为1×106 CFU，同时筛选出γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、白蛋白等多个评价指标可用于评估模型建立效果，为KPLA的研究提供了良好的模型基础。

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（责任编辑：林玲娜）