虾青素对13月龄罗曼粉蛋鸡卵巢组织结构和Sirtuin基因家族表达的影响

摘 要：卵巢是影响蛋鸡产蛋性能的重要器官，产蛋期卵巢生理机能衰退会导致产蛋率下降。本文旨在研究不同水平虾青素对13月龄罗曼粉蛋鸡卵巢组织和Sirtuin基因家族表达的影响。选取16只健康、体重相近的13月龄罗曼粉蛋鸡，随机分为4组，每组4个重复，分别为对照B组、试验LC组、MC组和HC组。所有蛋鸡饲喂相同的基础日粮，每日饲喂三次。对照组B额外灌喂葵花籽油4 mL，试验组LC、MC和HC分别额外灌喂4、20、100 mg/kg体重的虾青素（溶剂为葵花籽油）4 mL。饲喂方式为每天下午18：00直接灌服。各组温度保持在（25±3）℃，湿度维持在65%～80%，试验期25 d。结果显示，灌喂虾青素会使蛋鸡卵巢组织结构着色点增多、着色加深，卵泡壁增厚，卵泡数量有所增加。试验MC组卵巢组织中的Sirt2、Sirt3基因表达量极显著高于对照组（Plt;0.01），Sirt6、Sirt7基因表达量显著高于对照组（Plt;0.05），LC组卵巢组织中的Sirt1基因表达量极显著高于对照组（Plt;0.01）。综上所述，虾青素能够改善蛋鸡卵巢组织结构，延缓卵泡衰老，促进卵巢中Sirtuin基因家族的表达，其中20 mg/kg的剂量效果最佳。本试验结果可为虾青素调控卵巢生理功能机制的研究提供一定的参考。

关键词：虾青素；卵巢；Sirtuin；蛋鸡

中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2024）12-0005-07

家禽的繁殖系统由卵巢和输卵管两部分组成，卵巢是影响蛋鸡产蛋性能的一个重要器官。马艳粉[1]研究表明，随着产蛋周龄的增加，蛋鸡卵巢中的卵泡发生更多闭锁，大白卵泡和小白卵泡数量显著下降。姜礼文等[2]研究表明，蛋鸡卵巢机能下降可能与氧化应激加重有关。Sirtuins是一个需要NAD+作为底物来维持酶活性的蛋白去乙酰化酶家族，在组织中的表达具有高度保守性[3]，在细胞凋亡、线粒体生物合成、脂质代谢、脂肪酸氧化、细胞应激反应等多种细胞过程中都发挥了重要作用[4]。目前人类公认的Sirtuin基因家族成员有7个，且有不同的亚细胞定位，例如Sirt1、Sirt6和Sirt7主要定位在细胞核内，Sirt2主要分布在细胞浆中，Sirt3、Sirt4和Sirt5则位于线粒体内[5]。

本实验室前期研究表明，姜黄素（Curcumin，Cur）和斑蝥黄等天然抗氧化剂能够有效改变蛋鸡卵巢组织形态结构，缓解卵巢损伤[6-8]。虾青素（Astaxanthin，AST）又名虾红质、虾黄素，化学名3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，是一种广泛存在于雨生红球藻中的多功能型类胡萝卜素，抗氧化能力是维生素E的500倍，被誉为“超级维生素E”，且没有副作用[9-11]。贺维朝[12]研究发现虾青素通过增强蛋鸡抗氧化能力，减少卵巢细胞凋亡，促进生殖激素释放，从而提高卵巢中的卵泡数量，降低卵泡闭锁率，改善了卵巢衰退的系列表征。但目前对虾青素如何影响蛋鸡体内Sirtuins表达调控的研究相对较少，因此本试验通过额外灌喂虾青素，观察蛋鸡卵巢组织切片，并检测Sirtuins基因的表达量变化，研究结果可为虾青素调控蛋鸡卵巢功能的机制研究提供一定的理论依据。

1" 材料与方法

1.1" 试验仪器

立式压力蒸汽灭菌器（LDZM-75），上海申安医疗器械厂；冷冻离心机（3K15），扬州有限公司；PCR仪（621BR31414），伯乐生命医学产品上海有限公司；凝胶成像分析仪，北京誉朗科技有限公司；三恒电泳仪（DYY-10型/ECP3000），北京市六一仪器厂；4 ℃冰箱，北京福意电气有限公司。

1.2" 试验试剂

Trizol总RNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；RNA反转录试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；100 bp DNA Marker，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；PCR mix，康为世纪公司；琼脂糖，北京瑞达恒辉科技发展有限公司；EB替代品，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3" 试验设计

试验选取16只13月龄罗曼粉蛋鸡，随机分为4组（对照B组、试验LC组、MC组和HC组），每组4个重复，每个重复1只鸡。所有处理饲喂相同的基础日粮，日粮组成及营养水平见表1。对照组B额外灌喂葵花籽油4 mL，试验组LC、MC和HC分别额外灌喂4、20、100 mg/kg体重的虾青素（溶剂为葵花籽油），灌服时间为每天下午18：00。试验期为25 d。

1.4" 样品采集

试验结束时，采用断颈的方式处死试验动物，及时取出完整卵巢，用PBS溶液清洗干净后，将卵巢组织剪成黄豆粒大小，置于4%多聚甲醛中保存，用于制作组织切片；再收集4管黄豆大小的卵巢组织放在事先加入Trizol试剂的EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后续分子试验。

1.5" 卵巢形态测定

卵巢组织于 4%多聚甲醛中固定24 h后，将其切成大小为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的方块，后经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（厚度5 μm）、展片、烘干、水洗、HE染色，用中性树胶封片，贴上标签并编号。制片处理完成后进行图像采集，在光学显微镜下进行定位和拍摄，保存图片进行后续对比分析。

1.6" Sirtuin基因家族表达测定

使用Trizol法提取卵巢组织中RNA，采用RNA反转录试剂盒（北京全式金）将RNA反转录合成cDNA，通过PCR扩增目的条带。PCR体系（20 μL）：PCR mix 10 μL、 ddH2O 6 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL。反应程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸 10 min；12 ℃保存。本试验设计的所有引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成，引物序列见表2。

扩增完成后，制备1%的琼脂糖凝胶，放入装有1×TBE电泳缓冲液的电泳池中对PCR扩增产物进行电泳，电压为120 V，电流为130 mA，电泳30 min。置于凝胶电泳成像系统上进行观察分析结果。

1.7" 统计分析

利用光学显微镜对蛋鸡卵巢组织切片进行观察分析；先使用ImageJ软件对DNA荧光条带进行灰度分析，所分析出来的数据整合至Excel 2016软件，求出平均值和标准偏差，利用SPSS软件中Duncan’s多重比较检验，用Graphpad Prism软件作出柱状图。Plt;0.05表示差异显著，Plt;0.01表示差异极显著。

2" 结果与分析

2.1" 虾青素对13月龄罗曼粉蛋鸡卵巢组织的影响

蛋鸡卵巢组织形态如图1所示。观察各组的初级卵泡，可以看出对照B组卵泡内容物着色点最多，卵泡形状也最不规则，多呈不规则环形。而随着灌服虾青素剂量的增加，各试验组的卵泡异常状况有所改善，初级卵泡形态相对规则。观察各组的次级卵泡，可以看出各试验组尤其是HC组卵泡密集、发育良好，且次级卵泡的内容物多。观察各组的成熟卵泡，可以看出B组成熟卵泡结构形态细节不太清晰，各试验组卵泡发育良好、形态饱满圆润、内壁薄而清晰、颗粒层厚。

对比分析得到，B组卵巢组织切片中可见视野里成型的各级卵泡数量较少，同时结构不规则。LC组卵巢组织切片中卵泡内容物丰富；MC组卵巢组织切片中卵泡发育好，视野中有大片卵泡密集，次级卵泡以及成熟卵泡数量多，簇拥成团，卵巢上密布着小黄卵泡和大白卵泡；HC组卵巢组织切片中卵泡发育好，细胞排列较整齐，细胞核边界较清晰，颗粒细胞层增多，卵巢上密布着小黄卵泡和大白卵泡。

综上，三个试验组的卵泡相比对照组发育程度更为良好，数量更为密集，表明适当添加虾青素可能延缓卵泡的衰老。

2.2" 虾青素对13月龄罗曼粉蛋鸡Sirtuin基因家族表达的影响

对内参基因β-actin和Sirtuin基因扩增产物进行凝胶电泳检测，凝胶成像系统显示，内参基因和Sirt基因的扩增条带单一且清晰可见，位置大小合适（图2a）。对凝胶电泳后所得出的条带进行灰度分析，各基因检测值除以内参基因整理得出的结果见图2b。LC组的Sirt1表达量，MC组的Sirt2和Sirt3表达量均极显著高于B组（Plt;0.01）。同时，MC组的Sirt6和Sirt7表达量均显著高于B组（Plt;0.05）。HC组Sirt基因的表达量与B组无显著差异（Pgt;0.05）。各处理组间Sirt4和Sirt5的表达量差异均不显著（Pgt;0.05）。由此可以表明，虾青素能提高鸡卵巢中Sirtuin基因家族的表达量，尤其是LC组（4 mg/kg）对Sirt1的表达量和MC组（20 mg/kg）对Sirt2、Sirt3、Sirt6、Sirt7的表达量有显著提升效果。

3" 讨论

3.1" 虾青素对卵巢组织的影响

氧化应激反应是机体内氧化与抗氧化失衡的状态，会导致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的产生[13-14]。ROS是影响卵母细胞质量和发育潜能的主要因素之一，过多的ROS会影响卵母细胞成熟并阻滞胚胎发育[15]，而细胞抗氧化系统可使卵母细胞免受ROS的损害[16]。蛋鸡进入产蛋后期后，体内的新陈代谢速率开始减慢，抗氧化能力下降，ROS过度积累，从而损害卵巢的生理功能。虾青素可中和游离态氧，清除自由基，避免发生链式反应，抑制脂质过氧化，保护膜结构，使细胞免受氧化[17]。

本次试验发现，相对于对照组，试验组卵巢组织发育更好，可以看到成熟的卵泡，随着虾青素浓度的增加，着色点增多、着色加深，卵泡壁增厚明显，卵泡数量同样逐渐增多。这表明虾青素可能会促进卵巢发育，增加卵泡数量，进而提高产蛋率[18] 。

3.2" 虾青素对蛋鸡卵巢组织中Sirtuins基因表达的影响

Sirtuins能够调控抗氧化酶的活性，清除过量的ROS，提高卵母细胞抗氧化能力[19]。有研究表明，Sirtuins与原始卵泡数量呈正相关，能够延缓原始卵泡激活和闭锁，其表达缺陷会减少卵泡数量，加速原始卵泡的耗竭[20]。研究表明，Sirt1通过抗氧化修复 DNA 损伤、去乙酰化调控代谢和调控促凋亡因子来延缓细胞衰老和凋亡[21]。Sirt2表达量降低是导致卵母细胞年龄依赖性损伤的众多原因之一，老化的卵母细胞中ROS水平激增，抗氧化能力降低，而通过促进Sirt2的表达可使老龄小鼠卵母细胞的ROS水平降低，恢复卵母细胞的发育能力[22-23]。Sirt3对卵巢储备和卵泡发育、卵母细胞减数分裂和胚胎植入前的发育进程、卵母细胞的老化以及颗粒细胞功能都具有重要的调控作用[24]。Sirt4可以抑制肿瘤细胞中E-钙黏蛋白的表达以及上皮组织-间叶组织的转化过程，从而抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移能力[25]。抑制Sirt5蛋白表达会使早期胚胎的发育能力降低[26]。研究发现，小鼠卵巢中Sirt1、Sirt3和Sirt6的表达水平与卵巢始基卵泡池的大小显著相关，可以看出这些Sirtuins与卵巢的储备功能有着密切的联系，并且可以通过其表达量判断卵巢寿命[27]。Sirt7表达抑制会干扰胎鼠卵母细胞的减数分裂过程[28]。Sirtuin家族成员虽然各具重要且独特的功能，但是各个成员之间相互也存在着重要的联系，既相互影响又共同协调。如果有某个成员的表达受到干扰，则其他成员的功能亦会紊乱甚至缺失。

目前虾青素在Sirt1的表达机制方面有少许研究，但对Sirtuins家族的其他基因少有涉及。本次试验的结果表明，与对照组相比， MC组的Sirt2和Sirt3基因表达量极显著提高，Sirt6和Sirt7基因表达量显著提高，LC的Sirt1基因表达量极显著提高，可以推测适量的虾青素能够调控鸡卵巢中Sirtuin基因家族表达量，延缓蛋鸡卵巢组织细胞衰老和凋亡。

4" 结论

虾青素能够改善蛋鸡卵巢组织结构，延缓卵泡衰老，促进卵巢中Sirtuin基因家族的表达，其中20 mg/kg的剂量效果最佳。

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Effect of Astaxanthin on Ovarian Tissue Structure and Sirtuin Gene Expression in 13-month-old Roman Laying Hens

Abstract：" The ovary is an important organ which affects laying performance of laying hens. The decline of physiological function of ovary during laying period will lead to the decrease of laying rate. The aim of this study was to investigate the effects of different levels of astaxanthin on ovarian tissue structure and Sirtuin gene expression in 13-month-old Roman laying hens. 16 healthy 13-month-old Roman laying hens with similar body weight were randomly divided into 4 groups with 4 replicates in each group， The 4 groups were control group B， experimental group LC， MC and HC respectively. All layers were fed the same basic diet three times a day. The control group was fed with 4 mL sunflower seed oil， and the experimental groups （LC， MC， HC） were fed with 4 mL of astaxanthin-sunflower oil mixture at 4， 20 and 100 mg/kg body weight， respectively. Hens were perfused with astaxanthin at 18：00 pm every day. The temperature and humidity of each group were maintained at （25±3） ℃ and 65%～80% respectively for 25 days. The results showed that administration of astaxanthin could increase the staining spots， deepen the staining spots， thicken the wall of follicles and increase the number of follicles. The expression levels of Sirt2 and Sirt3 in MC were significantly higher than those in control group （Plt;0.01）. The expression levels of Sirt6 and Sirt7 in MC ovarian tissues were significantly higher than those in control group （Plt;0.05）. The expression level of Sirt1 gene in LC ovarian tissues was significantly higher than that in control group （Plt;0.01）. In conclusion， Astaxanthin can improve ovarian tissue structure， delay follicle senility and promote the expression of Sirtuin gene family in ovary of laying hens， and the dose of 20 mg/kg has the best effect. These results provide reference for studying the regulatory mechanism of astaxanthin on ovary function of hens.

Keywords：" Astaxanthin; Ovary; Sirtuin; Laying hens