6株核桃腐烂病菌的分子鉴定及生物学特性比较

摘要：为探究核桃腐烂病菌的分类地位及生物学特性，本研究基于分子生物学方法对6株菌落形态有差异的核桃腐烂病菌进行多基因联合鉴定，并进一步探究其致病性及生物学特性的差异。系统进化树显示，44-9-2B与Cylospora melnikii聚为一支，且自举支持率为100％；菌株44-1-2C、51-1-3C与C.chrsosperma聚为一支；菌株49-2-IA、49-9-4D、53-1-3F与Valsa sordida聚为一支。致病性检测表明，44-9-2B致病性最强，也最先产生分生孢子角，其次为菌株44-1-2C和51-1-3C，最后是菌株53-1-3F。生物学特性研究表明，6株致病菌最适生长温度均为28℃，最适pH值为6，光照对6株致病菌的生长有促进作用，各致病菌的最适氮、碳源不同。该研究结果可为核桃树腐烂病的防治提供理论依据。

关键词：核桃腐烂病；分子鉴定；生物学特性；致病性

中图分类号：S436.64 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）12-0098-07

核桃是世界上重要的坚果和木本油料树种，面积及产量在各类干果中均居首位。中国是核桃生产大国，产量达365万t，居世界第一。新疆是核桃栽培的发源地，也是中国核桃主产区之一，种植历史悠久，主要种植在南疆，以阿克苏地区、喀什地区、和田地区为主。核桃作为中国重要的木本油料产业之一，在保护生态、促进贫困地区经济发展、实现我国乡村振兴战略等方面发挥着重要作用。

壳囊孢属（Cytospora）真菌是引起核桃等林木腐烂病的主要病原菌，树木被侵染后会出现枝枯、坏死等症状，导致树势衰弱，世界各地均有发生，能够危害的寄主多达80余种。Index Fungorum中记载了700余种壳囊孢属真菌。目前，新疆已记录壳囊孢属真菌50余种，其中金黄壳囊孢菌（Cytospora chrsosperma）在新疆的地理分布及寄主范围最广。杜琴报道引起新疆林木腐烂病的病原菌有3种（VaLsa ceratosperma、Vsordida、V.malicola）；郭开发等鉴定出C.chrysosperma（有性型V.sordida）为主要病原菌：Zhao等报道了伊犁的腐烂病菌C.niea；刘础荣等研究发现新疆核桃树腐烂病的主要病原菌是V.sordida；李猛等报道了在阿拉尔鉴定出核桃腐烂病的病原菌为裂褶菌（Schizophyltum commune）。综上所述，在新疆引起核桃腐烂病的病原菌具有多样性。

本研究拟对6株菌落形态有差异的核桃腐烂病菌进行形态观察、致病性检测以及生物学特性分析，并通过多基因联合分析确认它们的分类地位及进化关系，旨在为新疆核桃树腐烂病防治提供理论参考。

1材料与方法

1.1试验材料

6株致病菌菌株分别为：51-1-3C、49-2-1A、44-1-2C、44-9-2B、49-9-4D、53-1-3F，由南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室提供。

核桃枝条采集于塔里木大学园艺试验站，核桃树品种为新翠丰，选取2年生粗细一致的健康枝条。

PDA培养基：1 L水中加入马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g。

PSA培养基：1 L水中加入马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂15 g。

OA培养基：1 L水中加入燕麦片30 g。

核桃组织培养基：1 L水中加入核桃枝条韧皮部20 g（煮沸30 min，纱布过滤）、酵母提取物20 g、琼脂粉15 g。

水琼脂培养基：1 L水中加入琼脂粉10 g。

1.2菌株形态学观察

用直径5 mm的无菌打孔器分别取培养3d的供试菌株菌落边缘菌饼接种于PDA培养基上，26℃条件下暗培养3d，第2天开始每天观察并记录菌丝生长情况（颜色、菌落形状、表面形态、有无子实体、表面分泌物）。

1.3菌株致病性检测

采用核桃枝条打孔接种法进行致病性验证。取粗细均匀的核桃枝条截成10-15 cm段，去除叶和芽，用0.6％的次氯酸钠溶液浸泡15-20min，用无菌水冲洗干净后在超净工作台风干。之后用石蜡封住枝条两端剪口，用打孔器对枝条打孔。将供试菌株接种于PDA平板上，26℃暗条件下培养3d，在菌落边缘处打取5 mm的菌饼，带菌丝的一面紧贴打孔部位接种于打孔的离体枝条上，接种部位用塑料薄膜包裹保湿。以空白PDA为对照。将接种枝条于26℃、保湿、黑暗条件下培养，隔天观察并记录发病情况。

1.4不同培养基及不同培养条件对菌丝生长的影响

设置PDA、PSA、OA、水琼脂、核桃组织培养基共5种培养基处理；温度设定0、10、15、20、25、28、30、35、40℃共9个处理；pH值设定4、5、6、7、8共5个处理：光照设定24 h黑暗、24 h光照、12h光照／12 h黑暗交替3种处理。以Czapek培养基为基础培养基，以乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉分别代替Czapek培养基的碳源，以酵母提取物、牛肉浸膏、蛋白胨、硫酸铵、甘氨酸分别代替Czapek培养基的氮源，进行不同碳源、氮源试验。将6株供试菌株按1.2的方法接种到不同处理中，每个处理重复3次，3d后采用十字交叉法测量并记录菌落直径。

1.5多基因联合分子鉴定

采用郝海婷等的方法快速提取DNA，以提取的DNA为模板，利用ITS、EFl-a、TUB2和ACT的引物分别对病原菌进行PCR扩增，所用引物序列及反应程序见表1。PCR反应体系（25uL）；DNA模板1 uL，2x Es Taq Master Mix 12.5uL，上、下游引物各0.3 uL，ddH20 10.9 uL。PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用ACOPTools V2软件进行序列比对和基因拼接，使用MEGA11.0软件以邻接法（NJ）构建系统发育树，用1 000次重复Bootstrap检验系统发育树各分支的支持率。

2结果与分析

2.1菌株形态学观察

6株致病菌在PDA培养基上均能迅速生长，各菌落正、背面均为白色，但菌落形态有所不同（表2，图1）。其中，44-1-2C的菌落呈辐射状生长，菌丝稠密，菌落边缘周围气生丝最稠密，培养到第5天菌落表面出现米黄色液体分泌物，第8天变成绿色；44-9-2B的菌落呈辐射状生长，菌丝较稀疏，蛛丝状；51-1-3C的菌落呈辐射状生长，菌丝较稠密、雪白色、羽绒状，在第8天表面产生子实体；49-2-1A的菌落呈辐射状生长，菌丝较稀疏，部分菌落边缘会出现桔红色分泌物，第7天开始产生子实体；49-9-4D的菌落呈辐射状生长，菌丝较稀疏，出现轮纹；53-1-3F的菌落呈圆形生长，菌丝较稠稀疏且出现轮纹。

2.2菌株致病性测定

致病性测定结果表明，接种6株致病菌均可导致核桃枝条发生腐烂病。接种后8天，接种部位出现褐色、水浸状病斑，且随时间的推移向四周扩散。接种后16天（图2），接种部位变成黑色，枝条干枯。根据枝条病斑大小，6株致病菌致病力由强到弱依次为44-9-2B、44-1-2C、51-1-3C、49-2-1A、49-9-4D、53-1-3F。观察发现，菌株44-1-2C、44-9-2B在第13天产生分生孢子角，51-1-3C、49-9-4D在第20天产生分生孢子角，49-2-1A在第24天产生，53-1-3F未产生分生孢子角。

2.3菌株生物学特性比较

2.3.1培养基种类对茵丝生长的影响 由表3可知，6株致病菌均能在5种培养基上生长，但菌落直径存在显著差异。其中，44-1-2C对核桃组织培养基利用率较高，其余分离株在核桃组织培养基上生长较慢，利用率基本相同。菌株51-1-3C、44-1-2C、53-1-3F、49-9-4D对5种培养基的利用情况基本相似，在PDA培养基上生长较好。菌株49-2-1A、44-9-2B则对PSA培养基利用率较高。

2.3.2温度对茵丝生长的影响 由图3知，6株致病菌均能在15-35℃条件下生长，其中菌株44-1-2C、44-9-2B在低温（10℃）下能够缓慢生长，所有菌株在40℃高温下均不能正常生长，表明它们对高温的适应性较差。各菌株最适生长温度区间为25-30℃，最适生长温度为28℃。

2.3.3pH值对茵丝生长的影响 由图4可见，6株致病菌均能在5个pH值处理下生长，最适pH值区间值为5-6，最适pH值为6。在中性至弱酸性条件下，菌落生长好于弱碱性条件。

2.3.4光照对菌落生长的影响 6株致病菌均能在3个光照处理下生长，但不同光照处理下菌落直径存在差异（表4）。光照对各致病菌的菌落生长有明显的促进作用。

2.3.5碳、氮源对菌落生长的影响 由表5可知，6株致病菌在不同碳源、氮源培养基上均能生长，但菌落直径存在差异。其中，44-9-2B在以乳糖为碳源的培养基中生长最好；51-1-3C、49-2-1A在以葡萄糖为碳源的培养基中生长最快；44-1-2C、49-9-4D、53-1-3F在以可溶性淀粉为碳源的培养基中生长最快。致病菌株在以蛋白胨、牛肉浸膏和酵母提取物为氮源的培养基中菌落直径较大，硫酸铵、甘氨酸作为氮源不适合各致病菌的生长。

2.4多基因联合分析

选择ITS、ACT、EFl-a和TUB2的完整序列，以Diaporther vaccinii（CBS 160.32）为外群，构建多基因联合系统发育树。参考菌株序列的GenBank登录号如表6所示。结果（图5）显示，菌株44-9-2B与C.elnikii聚于一支，自举支持率为100％，表明两者亲缘关系极近：菌株44-1-2C、51-1- 3C与C.chrysosperma聚于一支，自举支持率为55％；菌株49-2-1A、49-9-4D、53-1-3F与V.sordida聚于一支，自举支持率为65％。

3讨论与结论

本研究在致病菌形态观察过程中发现，6株致病菌在PDA培养基表面形态有所不同，其中49-2-1A部分菌丝会变成桔红色，而44-1-2C产生米黄色液体。致病性测定发现，6株致病菌均能表现出致病现象，但致病强弱有所区别，44-9-2B菌株致病性最强，且最先产出分生孢子角，而53-1-3F只表现出致病性，不产生分生孢子角。

为了明确这6株致病菌的分类地位，本研究通过ITS、EFl-a、TUB2和ACT多基因联合建树，得出44-9-2B与C.metnilm聚为一支且自举支持率较高，可确定44-9-2B为C.melnikiio Norphanphoun等于2017年通过系统发育分析及形态学鉴定确定了C.melniku是一个新种，Fan等2020年在我国新疆地区首次发现该菌。44-1-2C、51-1-3C与C.chrysosperma聚为一支，49-2-1A、49-9-4D、53-1-3F与V.sordida聚为一支，上述5株致病菌自举支持率低。其原因可能是本研究选用的4种引物无法将5种菌株具体分类，需采用LSU、RPB2等更多的引物进行基因联合建树，或采用全基因组测序进行全面分析。本研究中C.melnikii（44-9-2B）为强致病菌，国内鲜有报道，可以进一步深入研究其形态特性和生态环境，探索有效的防治方法，其余5种致病菌与刘础荣等、李春艳、翟亚伟的研究结果相同。

为了探究病原菌的最适生长环境，为防控措施提供理论依据，对这6株致病菌进行生物学特性比较。结果显示：6株致病菌最适温度区间为25-30℃，最适温度为28℃，与陈晓忍的研究结果相同；6株致病菌在pH值4-8之间都能正常生长，最适pH值为6，这与翟亚伟的研究结果一致；不同光照处理下，6株致病菌均能在连续黑暗、光暗交替和连续光照条件下生长，但光照对各菌株的菌落生长有明显的促进作用，与刘应敏、刘振亚等的研究结果一致；6株致病菌均能在Czapek基础培养基及供试其他碳源、氮源培养基上生长，其中44-9-2B在以乳糖为碳源的培养基生长最好，49-2-1A、51-1-3C在以葡萄糖为碳源的培养基中生长最快，49-9-4D、53-1-3F、44-1-2C在以可溶性淀粉为碳源的培养基中生长最快。可见，各菌株最适碳源不同，这与赵颖、邢红亮等的研究结果相同；以酵母提取物为氮源最有利于各菌株的菌丝生长，其次是牛肉浸膏和蛋白胨，而硫酸铵和甘氨酸则难以被菌株利用，这与孙朝华、尹永香的研究结果一致。不同碳、氮源研究结果表明碳源对6株致病菌株生长影响较大。

综上所述，本研究对6株致病菌进行了形态观察、致病性测定、分子鉴定以及生物学特性的比较分析。结果表明，6株致病菌在PDA培养基上表现出不同的形态特征，其中49-2-1A和44-1-2C菌株差异最为显著。致病性测定显示所有菌株均具有致病性，44-9-2B为强致病性菌株，且最先产出分生孢子角。通过多基因联合建树分析，44-9-2B被确定为Cytospora metnikii，而其他5株致病菌的分类需进一步研究。生物学特性比较结果显示；6株致病菌最适温度区间为25-30℃；最适pH值为6；光照对6株致病菌生长有促进作用；不同菌株对不同碳源的利用率不同，44-9-2B对乳糖的利用率高，而其他菌株在葡萄糖或可溶性淀粉为碳源的培养基中生长最快：最佳氮源为酵母提取物。