丁酸钠对脂多糖联合D-氨基半乳糖诱导小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制

［摘 要］ 目的：探讨丁酸钠 （NaB） 脂多糖 （LPS） 联合D-氨基半乳糖 （D-Gal） 诱导小鼠急性肝损伤的保护作用，并阐明其作用机制。方法：30只雄性昆明小鼠随机分为对照组、模型组和NaB组，每组10 只。NaB 组小鼠给予200 mg·kg-1·d-1 NaB，对照组和模型组小鼠给予等体积无菌水。模型组和NaB 组小鼠腹腔注射20 μg·kg-1 LPS 和600 mg·kg-1 D-Gal 诱导建立小鼠急性肝损伤模型。检测各组小鼠体质量和肝脏质量，计算肝脏指数。HE 染色观察各组小鼠肝脏组织病理形态表现，试剂盒检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT） 和天门冬氨酸氨基转移酶（AST） 活性及肝脏组织中总超氧化物歧化酶（T-SOD） 和过氧化氢酶（CAT） 活性及丙二醛（MDA） 水平，Western blotting 法检测各组小鼠肝脏组织中核因子E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶1（HO-1）蛋白表达水平。结果：各组小鼠体质量比较差异均无统计学意义（Pgt;0. 05）；与对照组比较，模型组小鼠肝脏指数明显升高（Plt;0. 01）；与模型组比较，NaB 组小鼠肝脏指数明显降低（Plt;0. 01）。HE 染色观察，对照组小鼠肝脏组织结构正常，肝细胞边界清晰、大小一致，围绕中央静脉呈放射状均匀排列，且核位于细胞中央；模型组小鼠可见肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，多发灶状肝细胞坏死，炎症细胞浸润及出血；与模型组比较， NaB 组肝细胞形态结构得到改善， 炎症浸润减少。与对照组比较， 模型组小鼠血清中ALT 和AST 活性均明显升高（Plt;0. 01）；与模型组比较，NaB 组小鼠血清中ALT 和AST 活性均明显降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织中T-SOD 和CAT 活性均明显降低（Plt;0. 01），MDA 水平明显升高（Plt;0. 01）；与模型组比较，NaB 组小鼠肝脏组织中T-SOD 和CAT 活性均明显升高（Plt;0. 05或Plt;0. 01），MDA 水平明显降低（Plt;0. 01）。Western blotting法检测，与对照组比较， 模型组小鼠肝脏组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平均明显降低（Plt;0. 05）； 与模型组比较，NaB组小鼠肝脏组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平均明显升高 （Plt;0. 01）。结论：NaB对LPS/D-Gal诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与NaB 上调肝脏组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达和增加抗氧化酶活性，进而减轻肝脏氧化应激水平有关。

［关键词］ 丁酸钠； 急性肝损伤； 氧化应激； 核因子E2 相关因子2； 血红素加氧酶1

［中图分类号］ R459. 3 ［文献标志码］ A

肝硬化、病毒性肝炎和肝癌等肝脏疾病每年造成200 余万人死亡， 占全球死亡人数的4% ［1］。急性肝损伤是指由感染、酒精中毒和药物等多种因素导致的急性肝脏功能损害及肝细胞坏死， 是肝脏疾病的重要诱因［2］。急性肝损伤发展迅速，诊治不及时可导致急性肝衰竭， 危及患者生命。急性肝损伤持续性发生将转变为慢性肝损伤， 进一步导致肝硬化和肝癌。肝损伤是一个发病率和死亡率较高的世界性健康问题，目前除肝移植外，尚无有效的治疗方法， 受肝脏供体的限制， 仅有少部分患者接受了有效的治疗［3-4］。因此，探索安全、天然和有效的急性肝损伤防治药物具有重要意义。丁酸钠（sodium butyrate， NaB） 为天然存在的短链脂肪酸盐， 是大纤维食物经细菌发酵的主要代谢产物， 结构简单且不良反应少，具有肠道屏障功能保护、抑制炎症和抗氧化等作用， 开发应用前景良好［5-7］。近期有研究［8-9］ 证实NaB 在肝功能保护方面具有潜能。研究［10］ 显示：氧化应激是诱发肝损伤的主要病理过程之一。肝细胞坏死会随着过氧化氢酶（catalase， CAT） 和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）等抗氧化酶活性的降低而恶化。因此， 抑制氧化应激可以成为缓解急性肝损伤的靶标。脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 联合D- 氨基半乳糖（D-galactosamine， D-Gal） 可造成肝细胞变性坏死， 其建立的小鼠急性肝损伤模型与人类急性肝损伤的病理特征相似， 常用于探索肝损伤机制和潜在防治药物。核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2） 是一种重要的转录因子， 是改善不同氧化应激和炎症相关疾病所必需的细胞因子［11］。血红素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1） 是一种可诱导的酶，对暴露于多种刺激， 如病毒和细菌产物， 包括LPS、细胞因子、癌基因、丝裂原及生长因子，所引起的炎症过程和氧化组织损伤具有保护作用。Nrf2 是HO-1 表达的主要激活剂［ 12］。研究［ 13］显示： 上调Nrf2 蛋白表达可增强相关抗氧化酶的活性， 从而改善急性肝损伤。研究［14］ 表明：NaB 通过促进Nrf2 的表达刺激下游抗氧化酶的转录， 从而有助于改善高脂肪饮食诱导的氧化应激。因此，本研究通过LPS/D-Gal 诱导构建急性肝损伤小鼠模型， 探讨NaB 对急性肝损伤小鼠的影响，并从氧化应激的角度阐明其可能的机制， 为NaB开发利用及急性肝损伤防治奠定基础。

1 材料与方法

1. 1 实验动物、主要试剂和仪器 30只雄性昆明小鼠，体质量（20±2） g，购于湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK （湘）2019-001。NaB 购于美国Sigma-Aldrich 公司，血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotransferase， AST）、总 SOD （total SOD，T-SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA） 和CAT 试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，Nrf2 和HO-1 购于武汉三鹰生物技术有限公司，β-actin 购于杭州华安生物技术有限公司，兔二抗购于美国Abclonal 公司，鼠二抗购于武汉亚科因生物技术有限公司。电泳仪电源购于北京六一仪器厂，凝胶成像仪购于上海天能科技有限公司，酶标仪购于美国Bio-Tek 仪器有限公司。

1. 2 实验动物分组和模型制备 30雄性昆明小鼠随机分为对照组、模型组和NaB 组， 每组10 只，常规饲料喂养，自由饮水，12 h 光/暗循环。各组小鼠均采用灌胃给药方式，NaB 组小鼠给予200 mg·kg-1·d-1 NaB［15］， 对照组和模型组小鼠给予等体积无菌水，持续灌胃7 周。末次给药1 h 后，模型组和NaB 组小鼠腹腔注射20 μg·kg-1 LPS 和600 mg·kg-1 D-Gal 诱导建立小鼠急性肝损伤模型［16］。实验过程中，每周测定小鼠体质量，密切观察小鼠状态。取各组小鼠肝脏组织，称量肝脏质量，计算各组小鼠肝脏指数。肝脏指数=小鼠肝脏质量（g） /小鼠体质量（g）。

1. 3 HE 染色观察各组小鼠肝脏组织病理形态表现 将4% 多聚甲醛固定的肝脏组织脱水并包埋于石蜡块中，制备5 μm 厚的切片，用苏木精和伊红处理小鼠肝脏组织，切片，光学显微镜下观察各组小鼠肝脏组织病理形态表现。

1. 4 试剂盒检测各组小鼠血清中ALT和AST活性 模型小鼠建立6 h 后麻醉，采用眼球摘除法收集小鼠血液样本，分离血清，参照生化试剂盒说明书操作，检测各组小鼠血清中ALT 和AST 活性。

1. 5 试剂盒检测各组小鼠肝脏组织中 T-SOD 和CAT活性及MDA水平 取各组小鼠肝脏组织，按照1∶ 9 的比例将小鼠肝脏组织与预冷生理盐水混合匀浆，2 500 r·min-1 离心10 min，取上清，采用试剂盒检测各组小鼠肝脏组织中T-SOD 和CAT 活性及MDA 水平。

1. 6 Western blotting法检测各组小鼠肝脏组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平 取小鼠冷冻肝脏组织20 mg，提取组织总蛋白。样品通过SDS-PAGE 分离， 切出含有靶蛋白和内参的凝胶并转印。将PVDF 膜于5% 脱脂奶粉中封闭，并于4 ℃下与一抗孵育过夜，室温孵育二抗1～2 h，ECL 显影，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值， 以β-actin 为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1. 7 统计学分析 采用 SPSS 26. 0统计软件进行统计学分析。各组小鼠体质量和肝脏指数，血清中ALT 和AST 活性，肝脏组织中T-SOD 和CAT 活性及MDA 水平，肝脏组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平均符合正态分布， 以x±s 表示， 多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q 检验。以Plt;0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 各组小鼠体质量和肝脏指数 各组小鼠体质量比较差异均无统计学意义（Pgt;0. 05）。与对照组比较， 模型组小鼠肝脏指数明显升高（Plt;0. 01）。与模型组比较，NaB 组小鼠肝脏指数明显降低（Plt;0. 01）。见表1。

2. 2 各组小鼠肝脏组织病理形态表现 对照组小鼠肝脏组织结构正常， 肝细胞边界清晰、大小一致，围绕中央静脉呈放射状均匀排列，且核位于细胞中央。模型组小鼠可见肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，多发灶状肝细胞坏死，炎症细胞浸润及出血。与模型组比较，NaB 组肝细胞形态结构得到改善，炎症浸润减少。见图1。

2. 3 各组小鼠血清中 ALT 和 AST 活性 与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT 和AST 活性均明显升高（Plt;0. 01）。与模型组比较， NaB 组小鼠血清中ALT 和AST 活性均明显降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。见表2。

2. 4 各组小鼠肝脏组织中 T-SOD和 CAT活性及MDA水平 与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织中T-SOD 和CAT 活性均明显降低（Plt;0. 01），MDA 水平明显升高（Plt;0. 01）。与模型组比较，NaB 组小鼠肝脏组织中T-SOD 和CAT 活性均明显升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），MDA 水平明显降低（Plt;0. 01）。见表3。

2. 5 各组小鼠肝脏组织中 Nrf2和 HO-1蛋白表达水平 与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平均明显降低（Plt;0. 05）。与模型组比较， NaB 组小鼠肝脏组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平均明显升高（Plt;0. 01）。见图2。

3 讨 论

肝脏在调节新陈代谢、体内平衡和免疫活动方面发挥重要作用。LPS 作为一种经典的内毒素，可诱导肝细胞凋亡和坏死。D-Gal 是一种氨基糖，是抑制肝细胞中RNA 和蛋白质合成的肝毒性物质之一，可导致肝损伤。D-Gal 可特异性地增强肝脏对LPS 细胞毒性作用的敏感性，促进急性肝损伤的发生发展［17］。本研究结果显示：与对照组比较，模型组小鼠肝脏指数明显升高，血清中ALT 和AST 活性明显升高，出现明显细胞结构紊乱、坏死及炎症细胞浸润，提示急性肝损伤模型构建成功；与模型组比较，NaB 组小鼠肝脏指数明显降低，且NaB 明显改善了广泛的细胞坏死和炎症细胞浸润。ALT 和AST 是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的酶， 当肝细胞受损时，ALT 和AST 由肝细胞释放至血液中， 导致血清中ALT 和AST 活性升高。AST 和ALT 的血清活性已被公认为肝脏组织损伤的敏感血清学指标， 其异常升高可引起肝细胞损伤和坏死［18］。NaB 干预后， 因腹腔注射LPS/D-Gal 小鼠血清中ALT 和AST 活性明显降低，提示NaB 可有效缓解急性肝损伤。

氧化应激与急性肝损伤的发病有密切关联，抑制氧化应激可能是急性肝损伤发展的潜在预防措施［19］。SOD 与CAT 的功能相互关联，均可通过直接清除氧自由基发挥肝细胞保护作用。MDA 是脂质过氧化的最终产物，MDA 水平可提示肝脏氧化损伤的程度［20］。研究［21］ 显示：NaB 可通过提高抗氧化稳定性改善奶山羊亚急性瘤胃酸中毒。研究［22］发现：NaB 干预可减轻过氧化氢引起的氧化损伤，升高细胞中SOD 和CAT 等抗氧化酶活性，明显降低活性氧（resctive oxygen species，ROS） 和MDA水平。本研究结果显示：经过NaB 的干预，腹腔注射LPS/D-Gal 的急性肝损伤小鼠MDA 水平升高和CAT 及T-SOD 活性降低的情况被逆转。提示NaB具有抗氧化应激活性， 有助于清除ROS， 从而减轻急性肝损伤的严重程度。

抗氧化应激的机制是目前研究的热点，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、沉默调节蛋白1（silent information regulator protein 1， SIRT1） /Nrf2、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K） - 蛋白激酶B （protein kinase B，Akt）、Akt/叉头框蛋白O1 （orkhead box proteinO1，FoxO1） 和Nrf2/HO-1 等通路受到广泛关注，其中，Nrf2/HO-1 通路作为人体最关键的内源性防护系统之一，在保护机体免受氧化应激过程中发挥关键作用。在无应激条件下， Nrf2 在蛋白酶体中以Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1 （Kelch-likeECH-associated protein 1，Keap1） 依赖性方式不断泛素化和降解。在氧化条件下，Keap1 中关键半胱氨酸残基被共价修饰， 阻止其介导Nrf2 泛素化，新合成的Nrf2 可以积累并转移至细胞核中，与肌腱膜纤维肉瘤蛋白（musculoaponeurotic fibrosarcomaprotein，MAF） 蛋白二聚化，以促进细胞保护基因的转录。Nrf2 缺乏会加重小鼠原代肝细胞中ROS 的积累［23］。Nrf2/HO-1 信号传导在多种肝脏疾病中的关键作用已被证实，包括非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病和肝缺血再灌注损伤等［24-25］。TANG 等［26］研究发现：NaB 通过促进糖原合成酶激酶3 β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β） /Nrf2 信号通路和线粒体功能，防止高脂肪饮食诱导的肥胖大鼠的氧化应激。LUO 等［27］ 研究发现： NaB 通过G 蛋白偶联受体43 （G protein coupled receptor 43，GPR43） /β 抑制蛋白2（β-arrestin-2） /核因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 信号通路部分减少炎症反应，明显减轻了LPS 诱导的肝损伤。本研究结果显示：与对照组比较，急性肝损伤小鼠肝脏组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显降低，NaB 干预可明显上调Nrf2 和HO-1 蛋白表达。

综上所述，NaB 对LPS/D-GalN 诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用， 其作用机制可能与NaB上调肝脏组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达和减少肝脏氧化损伤，进而增加抗氧化酶活性有关。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：龙毅参与研究设计、实验质量控制和论文撰写，游子怡参与实验操作、数据收集和统计学分析，谭秀英参与研究设计和实验质量控制，张柔参与实验数据收集和文献检索，张钰浛参与实验操作和数据收集整理，杨丽娜参与研究设计、实验质量控制和论文审校。

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