小麦返青期白叶性状的转录组学分析

摘要 ［目的］为解析小麦（Triticum aestivum L.）白叶突变体叶色白化机制，以白叶突变小麦体和正常小麦为试验材料，从转录水平方向展开研究。［方法］以正常小麦和温敏白叶突变体小麦为材料，进行叶色变化过程的比较转录组学分析，挖掘调控小麦光合色素形成的调控机制。［结果］参与正常小麦叶片发育过程的DGEs数目是白叶小麦叶色由白转绿过程的2.57倍，且正常叶片发育过程的DGEs主要参与脂类、氨基酸、蛋白质、嘌呤、肌醇等生物大分子的代谢，而叶色由白转绿过程的DGEs主要参与光合作用、呼吸作用和糖代谢等过程；同时发现，小麦拥有已知植物光合色素代谢途径中的所有基因，其中的75个基因为DGEs，这些DGEs包含了所有叶绿素合成途径的基因和2个类胡萝卜素合成途径的基因，这些基因的表达模式分为7类（Ⅰ-Ⅶ），表达模式表明小麦叶绿素的生物合成受反馈调节，并且叶绿素合成受阻导致试验材料形成白叶，TaCAO可能是叶绿素合成受阻的主要影响因子。［结论］该研究为进一步研究小麦叶绿素形成机制奠定了基础。

关键词 小麦；白叶性状；比较转录组学

中图分类号 Q 75 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）23-0085-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.019

Transcriptomic Analysis of White Leaf Traits in Triticum aestivum L. at Regreening Stage

WANG Zhi-long，NAN Wen-zhi，LIU Ting-ting et al

（Life Science College of Yulin University，Yulin，Shaanxi 719000）

Abstract ［Objective］To decipher the mechanism of leaf color albinism in Triticum aestivum L.white-leaf mutants.［Method］This study conducted a comparative transcriptomic analysis of the leaf color change process using normal Triticum aestivumL.and temperature-sensitive white-leaf mutants.The aim was to uncover the regulatory mechanisms governing the formation of photosynthetic pigments in Triticum aestivum L..［Result］The results showed that the number of Differentially Expressed Genes （DGEs） involved in the development of normal Triticum aestivum L.leaves was 2.57 times that in the process of white leaf color turning green.DGEs in the normal leaf development process were mainly involved in the metabolism of lipids，amino acids，proteins，purines，and inositol，among other biomacromolecules.In contrast，DGEs in the process of leaf color turning from white to green were primarily involved in photosynthesis，respiration，and carbohydrate metabolism.Furthermore，it was found that Triticum aestivum L.possesses all the genes in the known plant photosynthetic pigment metabolic pathways，75 of which were DGEs.These DGEs included all genes of the chlorophyll synthesis pathway and two carotenoid synthesis pathway genes.Their expression patterns can be classified into seven categories （I to VII）.These patterns suggest that the biosynthesis of Triticum aestivum L.chlorophyll is subject to feedback regulation，and that impaired chlorophyll synthesis leads to the formation of white leaves，with TaCAO likely being the main factor affecting chlorophyll synthesis.［Conclusion］These findings provide a theoretical basis for further research into the chlorophyll formation mechanism in Triticum aestivum L..

Key words Triticum aestivum L.;White-leaf trait;Comparative transcriptomics

基金项目 国家自然科学基金项目（32160462）;榆林学院研究生创新基金项目（2022YLYCX08）。

作者简介 王志龙（1998—），男，陕西榆林人，硕士研究生，研究方向：作物遗传育种。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事旱区农作物节水技术研究。

收稿日期 2024-01-11；修回日期 2024-02-26

叶片是植物进行光合作用的主要器官，在叶片中叶绿素是最重要的光合色素之一，类胡萝卜素是辅助光合色素，叶绿素和类胡萝卜素在植物的生物过程中有着重要的作用［1-2］。调控叶绿素和类胡萝卜素的基因发生变化往往会导致植物叶色的异常［3-4］。目前，植物合成叶绿素和类胡萝卜素的一般通路已较为明晰［5］，在拟南芥中，已发现有15种酶和27个基因参与叶绿素的生物合成调控途径［6］。从细菌、真菌、藻类和植物等生物中分离出150余个调控类胡萝卜素形成的基因，它们编码类胡萝卜素合成途径中的20余种酶［7］。这些基因变异均都可能导致叶绿素和叶黄素含量发生变化［8-9］。叶色突变材料是研究光合色素生物合成、叶绿体发育以及开发基因遗传转化标记性状的理想材料［10］。

高通量测序具有测序成本低、时间短的特点［11］。这种技术可同时对数百万条序列进行测序，不仅丰富物种的遗传数据库，在功能基因的筛选和鉴定中也可以发挥作用。该技术促进了植物叶色研究领域发展，通过de novo转录组测序产生物种的遗传信息和预测可能的非编码 RNA。目前，多种叶色变异植物已被测序分析，如已经发现了许多由CHI生物合成途径突变而引起叶色变化的高等植物，如病毒诱导的CHLI（镁螯合酶I亚基）基因沉默降低了叶绿素含量并改变了叶绿体功能，导致豌豆中的叶绿体结构异常［12］，在银杏中下调的HEMA会导致叶绿素积累减少［13］。然而，在小麦叶色突变体中仅报道了少数编码Mg-螯合酶D、H和I亚基的CHRD、CHLH和CHLI基因［14］。小麦中叶绿素生物合成的调控机制还有待继续深入研究。笔者选用白叶突变小麦叶色变化前后的叶片，以及同一时期叶色正常的小麦叶片，构建4个RNA文库，进行转录组测序，分析叶色变化过程中叶片基因表达谱，挖掘调控小麦叶色变白的分子机制，以期为进一步研究小麦叶色变异的分子调控机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料和生长条件

试验材料于2020年10月4日种植于西北农林科技大学北校区杨凌试验站（34.16°N，108.05°E）。白叶小麦在正常温度时叶色为绿色，越冬时，低温诱导叶色变白，返青期叶色逐渐变绿。正常叶色小麦和白叶小麦分2组种植，每组3次重复，每次重复取10片叶子作为转录组混池。第1天，分别取白叶小麦的白色叶片及正常小麦的绿色叶片构建6个转录组混池；第5天，分别取白叶小麦变绿后的叶片，以及正常小麦的叶片构建6个转录组混池；共12个转录组文库。第1次取样，白叶小麦的白色叶片转录组混池记为WL，正常叶色小麦叶片的转录组混池记为GL。5 d后取样，白叶小麦转绿叶片的转录组混池记为HWL，正常叶色小麦叶片的转录组混池记为RGL。

1.2 RNA提取和Rna-Seq数据处理

利用Trizol试剂盒提取 RNA，Nanodrop 2000 对 RNA 的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，IN 值检测方法为 Agilent 2100 Nano，检测合格后进行文库构建和 Illumina 转录组测序，测序由百迈克生物科技有限公司完成。测序获得的原始序列 （Raw reads）去除接头（Adaptor）、含有 N（N 表示无法确定碱基信息）的比例大于 5%和低质量（质量值Q≤10 的碱基数占整个 read 的 20%以上）的数据后，得到净序列数（Clean reads）。利用Clean reads进行有参转录组分析，使用 HISAT2v2.0.5 将配对末端净序列数与小麦的参照基因组进行比对［15］。参考基因组为Triticum_aestivum.TGACv1.genome.fa。

1.3 差异表达基因、GO富集和通路分析

基因表达水平和差异基因富集分析通过featureCounts［16］计算匹配到每个基因的数据，并结合该基因的长度计算每个基因的 FPKM （reads per kilobases per million reads）值。利用 DESeq2 软件［17］对白叶小麦和正常小麦的基因进行差异表达分析，获得差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。使用clusterProfiler［18］软件进行差异表达基因的 GO 和 KEGG 富集分析。

1.4 小麦光合色素相关基因的分离

利用BLAST 2.2.28+ （ ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/LATEST/）软件，通过其他植物中已知的调控光合色素合成的基因检索小麦基因组和转录组中的小麦同源基因。将检索得到的50分以上且匹配序列长度大于120 bp的序列保留备用，进一步利用CDD （ https：/ / www.ncbi.nlm.nih.gov / cdd / ） 数据库分析它们的保守结构域。利用 MEGA 11 软件进行小麦中叶绿素调控基因的多序列比对和进化分析，采用邻近法构建系统进化树， bootstrap为1 000。

2 结果与分析

2.1 正常叶片和白叶突变体叶片发育的Rna-Seq分析

利用正常叶色小麦和白叶小麦的叶片构建了12个mRNA文库并测序，获得了50 634 256～ 62 110 976条原始序列（表1）。去除接头和低质量的序列后得到50 096 610～61 562 006条高质量序列，并且94.25%～95.40%的序列可以比对到基因组，表明测序质量和参考基因组满足高质量转录组的分析要求。

2.2 小麦叶片发育的差异表达基因

为了挖掘与小麦叶色变白相关的代谢机制，进行了样本间的比较转录组学分析。结果表明，WL和HWL之间共有6 298个差异表达基因，其中表达量上调的基因有3 654个，表达量下降的基因有2 644个。GL和RGL之间共有16 192差异表达基因，其中表达量上调的基因有8 973个，表达量下降的基因有7 219个。白叶小麦样本间的显著性差异基因极大减少，可能是由于光合作用显著降低，导致光合产物生物合成及其一系列相关的代谢在样本间受到抑制，进而抑制了细胞的生命活动。白叶小麦WL vs HWL和正常叶色小麦GL vs RGL间的共同表达基因为2 489个，数量显著少于2个材料间特异表达的基因，表明小麦叶色变白后显著影响了基因的表达，致使细胞生命活动发生了显著变化（图1）。

2.3 GO、KEGG富集和通路分析

分别对GL vs RGL显著性差异表达的基因以及WL vs HWL显著性差异表达的基因分别进行GO富集分析，结果表明，正常叶色小麦和白叶小麦的基因主要在细胞组分和分子功能有差异，其中正常叶色小麦显著差异基因特异参与核（nucleoid）、细胞连接（cell junction）、共质体（symplast）、超分子复合体（supramolecular complex）等细胞组分，白叶小麦显著性差异基因特异参与分子转导活性（molecular transducer activity）、信号转导活性（signal transducer activity）分子功能（图2、图3）。为了进一步挖掘调控小麦叶色变白相关基因参与的代谢通路，笔者将GL和RGL之间的显著差异表达基因及WL和HWL之间的

显著差异表达基因分别进行 KEGG 注释和富集分析（表2、表3）。结果表明，正常叶色小麦的差异表达基因主要参与糖类、脂类、氨基酸、蛋白质等初生代谢产物以及黄酮、类黄酮和光合色素等次生代谢产物的代谢过程，并且上述多种生物大分子的合成代谢都显著富集；白叶小麦由于光合同化作用受影响，初生物质代谢和次生物质代谢相对较少，并且光合作用、氧化磷酸化、淀粉和蔗糖代谢等显著富集。

2.4 小麦光合色素生物合成基因的特征

为了挖掘小麦中参与光合色素代谢相关的调控基因，利用植物中已知的36个光合色素合成途径的调控基因，通过TBLASTN（le-10）检索小麦转录组中表达的转录本，共发现135个表达的转录本，且每个已知的调控基因均能在小麦中找到转录本（表4）。筛选上述135个光合色素合成途径的转录本在GL vs RGL以及WL vs HWL中的显著差异表达基因（P<0.01），共发现75个显著差异表达基因。其中，与叶绿素相关的差异表达基因有56个，与叶黄素相关的差异表达基因有19个。通过对75个差异表达基因进行热图分析，笔者将它们的表达模式大致分为7类（Ⅰ～Ⅶ）。参与叶绿素代谢的差异基因中，除第 Ⅰ 类外，其余Ⅱ～Ⅳ类中所有的基因在WL中的表达均高于GL中，Ⅱ类基因在GL vs RGL中上调表达，在WL vs HWL中下调表达（图4）。参与叶黄素代谢相关的差异基因中，V类基因在WL中的表达均高于GL，第Ⅶ类基因在白叶小麦和正常小麦中的表达趋势相反（图5）。

3 结论与讨论

叶绿素（chlorophyll，Chl）是植物叶绿体参与光合作用的重要色素，叶色突变往往都伴随着叶绿素含量的降低，因此也被人称为叶绿素缺失突变。HirschBerg等［7］已经完成拟南芥叶绿素生物合成过程中全部27个基因的鉴定，其任一步骤异常都可能导致叶绿素的合成障碍。目前，在植物中发现了许多由Chl生物合成途径突变而引起的叶色变化，如镁螯合酶亚基Chl H氯氧化蛋白（CHLH）、镁原卟啉IX螯合酶（CHLD）和镁原卟啉IX甲基转移酶（CHLM）的表达受到抑制，可能是缺锌胁迫下玉米叶片叶绿素含量降低的原因［19］ 。有学者利用VIGS技术沉默合成第一步谷氨酸-tRNA合成酶相关基因得到的突变体材料叶绿素含量明显下降，植物叶片呈现白化、黄化现象［20］。CAO在Chl a/b比率调控中起着关键作用，植物在CAO过表达的植物中过度积累Chl b 。Zhu等［4］研究表明HEMC、HEME、CHLD、CHLM、PORA和CHLG的表达不同程度降低，可能是导致水稻叶色突变体中Chl a水平降低的主要因素。Zhang等［19-21］研究认为，作物中CHLM上调或者下调会引起叶绿素的上调或者下调，会导致作物中叶绿素的上升或者下降。然而，在小麦叶色突变体中仅报道了少数编码Mg-螯合酶D、H和I亚基的CHRD、CHLH和CHLI基因［14，19］。

该研究以正常叶色的小麦和温敏白叶突变体小麦为材料，进行叶色变化过程的比较转录组学分析，挖掘调控小麦光合色素形成的调控机制。DGE分析结果表明，正常叶色小麦GL vs RGL的DGEs数目是白叶小麦的叶色由白转绿（WL vs HWL）的2.57倍，表明白叶小麦由于光合色素缺乏，导致细胞生长发育延缓，参与调控细胞生命活动的DGEs较正常叶色小麦显著减少。GL vs RGL的DGEs主要参与脂类、氨基酸、蛋白质、嘌呤、肌醇等生物大分子的形成，促进细胞生长发育；WL vs HWL的DGEs主要参与光合作用、呼吸作用和糖代谢等过程，合成代谢能力较正常叶色小麦显著降低，更倾向于通过调节基础代谢过程维持细胞的生命活动。

小麦拥有植物中已知光合色素代谢途径的所有基因，笔者共发现75个小麦光合色素代谢相关的DGEs，它们的表达模式可以分为7类（Ⅰ～Ⅶ）。第Ⅰ类和第Ⅶ类中的DGEs主要包含TaCAO、TaZEP，它们在WL中的表达丰度最低。TaCAO和TaZEP分别位于叶绿素和胡萝卜素合成途径的下游，他们的基因表达丰度调控这2种光合色素的形成［20，22］。TaCAO和TaZEP的表达特征暗示了它们功能的缺失可能是小麦叶色变白的重要影响因素，与此同时，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ类中的DGEs在WL中的表达均高于GL，表明光合色素的生物合成途径存在普遍的反馈调节机制，途径下游基因的功能缺失会促进途径上游基因的表达。第Ⅴ类基因中的GGPPs基因在GL vs RGL中上调表达，在WL vs HWL中下调表达，香叶基二磷酸合酶（geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）可以催化合成GGPP，用于包括叶绿素、类胡萝卜素、VE等一系列重要化合物的合成，增强GGPPS表达可以提升烟草叶片叶绿素及类胡萝卜素含量［23-24］；第Ⅱ类基因，包含了TaGSA到TaCHLM通路的所有基因，它们的表达模式与GGPPs相同，表达模式表明在生长发育过程中，正常叶片叶绿素合成代谢增强；然而在白色叶片中，植物通过增强叶绿素合成相关基因的表达，促进叶绿素的形成，当白叶反绿后，积累的叶绿素通过反馈调节机制抑制上游调控基因的表达。75个DGEs除参与叶绿素合成途径外，只有GGPPs和TaZEP参与类胡萝卜素的形成，因此叶绿素合成受阻可能是该试验中白叶性状形成的主要原因，并且由叶绿素缺乏导致光合同化物合成受阻最终引起类胡萝卜素合成减少，形成白叶性状。综上所示，TaCAO可能是该试验中导致叶绿素合成受阻的主要因子，进一步分析 TaCAO的变异与生物学功能有关，有助于理解小麦光合色素代谢的调控机制。

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