衰老标记物沉默信息调节因子1、超氧化物歧化酶2、p21和Ku70在支气管扩张中的作用机制研究

【摘要】目的 探讨衰老标记物沉默信息调节因子1（Sirtuin1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、p21、Ku70 mRNA在支气管扩张（BE）中的表达差异，并分析其与BE严重程度的相关性。方法 选取2022年7月至2024年6月于广西国际壮医医院确诊的85例BE患者，作为疾病组，另纳入46名肺炎康复期或其他非慢性肺部疾病而接受肺泡灌洗的患者作为对照组，进行前瞻性研究；并根据BE严重程度将疾病组患者分为轻度、中度及重度。通过支气管镜检查获取肺泡灌洗液，提取RNA并进行逆转录，采用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）技术检测肺泡灌洗液Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表达情况，比较疾病组和对照组，不同严重程度疾病组Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表达水平；通过受试者工作特征（ROC）曲线分析Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表达水平对BE的诊断价值。结果 疾病组患者Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相对表达量均低于对照组，p21 mRNA相对表达量高于对照组；重度组Sirtuin 1、SOD2 mRNA相对表达量均低于轻度组，p21 mRNA相对表达量高于轻度组，Ku70 mRNA相对表达量低于轻、中度组（均P<0.05）。ROC曲线分析显示，Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA的相对表达量的最佳诊断截断值分别为0.983、1.068、1.223、0.860，且4 个衰老标志物的曲线下面积（AUC）均超过0.600，并以Ku70 mRNA的AUC最大，为0.721，诊断效能均良好（均P<0.05）。结论 BE患者对比健康人Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相对表达量均显著降低，p21 mRNA的相对表达量明显增高，和BE疾病进展相关，且Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA相对表达量对BE疾病程度均有良好的诊断价值。

【关键词】沉默信息调节因子1 ; 过氧化物歧化酶 ; 细胞周期蛋白 ; DNA修复因子 ; 支气管扩张 ; 作用机制

【中图分类号】R563 【文献标识码】A 【文章编号】2096-3718.2024.23.0115.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.23.036

支气管扩张（bronchiectasia，BE）是一种慢性进行性的气道炎症性疾病，其特征为持续性咳嗽、咳痰及气道结构不可逆性扩张和破坏。尽管已有研究揭示了气道感染、慢性炎症及气道结构破坏与BE相关[1]，但该疾病的确切病理机制尚未清晰。近年来，衰老生物学的快速发展为理解慢性疾病提供了新的视角，衰老标记物在多种慢性疾病中的异常表达已被广泛报道[2]。特别是沉默信息调节因子1（Sirtuin1），通过调节关键的细胞生长和应激反应蛋白有助于细胞抗氧化和延长寿命；超氧化物歧化酶2（SOD2）、p21及Ku70 mRNA分别在中和有害的自由基、控制细胞周期以响应DNA损伤及修复DNA双链断裂中发挥关键作用[3-4]。然而，这些衰老标记物在BE中的相关性研究尚属空白，因此，本研究旨在探讨Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA在BE患者肺泡灌洗液的表达差异，以及其表达情况与BE严重程度的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2022年7月至2024年6月于广西国际壮医医院确诊的85例BE患者，作为疾病组，另纳入46名肺炎康复期或其他非慢性肺部疾病而接受肺泡灌洗的患者作为对照组，进行前瞻性研究。对照组研究对象男性24例，女性22例；年龄42～64岁，平均（51.39±5.64）岁。疾病组患者中男性37例，女性48例；年龄34～65岁，平均（49.69±6.11）岁。两组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），组间可比。纳入标准：⑴符合《中国成人支气管扩张症诊断与治疗专家共识》 [5]中的相关诊断标准；⑵经胸部高分辨率CT（HRCT）诊断为BE；⑶入组前至少4周内无口服、静脉滴注或雾化吸入抗生素治疗（除了长期使用低剂量大环内酯类维持治疗），合并用药情况应尽量维持稳定；⑷对照组研究对象为同期住院治疗病情好转恢复至肺炎康复期继续接受肺泡灌洗的患者或其他非慢性肺部疾病如支气管异物需接受肺泡灌洗的患者。排除标准：⑴妊娠、恶性肿瘤疾病或合并严重疾病（如活动期肺结核或心肌梗死等）；⑵不愿意参加随访。本研究经过广西国际壮医医院医学伦理委员会审核批准（伦理批号：2022-057-03），研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 BE严重程度及分组 使用支气管扩张严重程度指数（BSI）量表[6]（0～26分），将85例BE患者分为轻度（0～4分，29例）、中度（5～8分，39例）、重度（≥9分，17例）。

1.2.2 肺泡灌洗液衰老标记物mRNA表达水平检测 在进行支气管镜肺泡灌洗术前，患者需完成血常规、凝血功能、输血前四项检查及心电图，并在术前6 h禁食、禁饮。手术采用局部麻醉，使用2%盐酸利多卡因注射液（广西南宁百会药业集团有限公司，国药准字H45020569，规格：5 mL∶0.1 g）对鼻腔和咽喉部进行表面麻醉。使用纤支镜（日本奥林巴斯公司，型号：Olympus P60）经鼻腔进入气管，根据胸部CT结果，通过活检孔注入生理盐水以清除痰栓，最后回收灌洗液，目标回收率为40%～50%。

使用TRIZOL试剂（Invitrogen，货号：15596026）结合氯仿进行RNA的粗提取，并通过异丙醇沉淀进一步纯化，得到的RNA在超微量分光光度计（Thermo Fisher，型号：NanoDrop Lite）上定量分析，并用无RNase水稀释至工作浓度，逆转录反应将RNA转换为cDNA，以备后续的基因表达分析。使用染料法荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测4种衰老标记物的表达水平，使用实时荧光定量PCR仪器（苏州阿尔法生物实验器材有限公司，型号：Q2000B）及多重PCR扩增试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，编号：KT109]，对Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70及HRRT1（作为内参基因）进行定量扩增分析。每个反应孔的体积设定为20 mL，包括2 mL的cDNA、10 mL的TB Green Premix Ex Tag Ⅱ、各0.8 mL的正反向引物（10 μmol/L），以及6.0 mL的无菌水。PCR程序包括95 ℃预变性5 min，随后40个循环，每个循环包括95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s的步骤，用于信号收集。每个样本进行3次独立测定，利用2-ΔΔCT方法计算肺泡灌洗液中Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA相对表达水平。

1.3 观察指标 ⑴Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在对照组与疾病组研究对象肺泡灌洗液中的表达情况。⑵Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在不同严重程度BE患者肺泡灌洗液中的表达情况。⑶Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在BE病情诊断中的准确性。通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估这些衰老标记物mRNA相对表达水平对BE的诊断价值。

1.4 统计学方法 使用SPSS 27.0统计学软件进行分析，计量资料经S-W法检验证实符合正态分布，用（ x ±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；通过ROC曲线分析评估这些衰老标记物mRNA相对表达水平对BE的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和疾病组研究对象肺泡灌洗液衰老标志物mRNA表达量 疾病组患者Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相对表达量均低于对照组，p21 mRNA相对表达量高于对照组，差异均有统计学意义（均P<0.05），见表1。

2.2 不同严重程度BE患者肺泡灌洗液中衰老标志物mRNA表达量 重度组Sirtuin 1、SOD2 mRNA相对表达量均低于轻度组，p21 mRNA相对表达量高于轻度组，Ku70 mRNA相对表达量低于轻、中度组，差异均有统计学意义（均P<0.05），见表2。

2.3 4种衰老标志物mRNA表达量对BE病情的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，4个衰老标志物 mRNA表达量的曲线下面积（AUC）均超过0.600，其中Ku70 AUC最大，为0.721，诊断效能均良好，差异均有统计学意义（均P<0.05），见图1、表3。

3 讨论

BE的病理机制涉及气道炎症、感染及结构破坏的复杂相互作用，尽管已有研究揭示了这些因素与BE的相关性[7]，但具体的作用机制仍不完全清楚，研究已表明，衰老标记物的变化与多种慢性疾病的发展有关[2]。例如，气道上皮细胞的衰老可能在BE的进展中发挥作用，但衰老标记物如Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA在BE中的表达及其与疾病严重程度的相关性尚需阐明。

BE的病理症状主要表现于肺部，肺部组织或其他肺部检测样本是反映衰老加速的最佳组织，因此本研究选取的检测样本是肺泡灌洗液。本研究结果显示，与对照组比，疾病组中Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相对表达量均降低，而p21 mRNA的相对表达量升高，且Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相对表达量随着病情严重而降低，p21 mRNA随着病情严重而升高，这表明在BE的病理过程中，可能存在抗氧化和DNA修复能力的减弱，以及细胞周期调控的改变。分析其原因，Sirtuin家族在人体成熟组织、胚胎期组织及生殖细胞中广泛存在[8]。研究发现，Sirtuin 1能够通过去乙酰化作用影响叉头蛋白盒转录因子1（FOXO1），从而抑制氧化应激反应，降低细胞损伤[9]。一项初步研究显示，BE患者气道中Sirtuin 1 mRNA的相对表达量较健康人明显减少[10]。在BE中，Sirtuin 1的表达下调可能通过促进细胞衰老、减弱抗氧化和抗炎能力，以及损害DNA修复机制，加剧气道炎症和结构损伤。

SOD2主要作用为中和超氧自由基，以防止氧化应激引起的细胞损伤。有研究表明，急性肺损伤小鼠对比正常鼠SOD2显著降低，槲皮素可干预激活Nrf2/HO-1信号通路转导，减轻氧化应激与炎症反应，提高SOD2，改善肺功能[11]。SOD2的降低可能意味BE患者气道上皮细胞清除活性氧的能力受损，导致氧化应激的累积，进而加剧气道炎症和组织损伤[12]。

Ku70蛋白是参与DNA双链断裂修复的主要分子之一。Sirtuin 1对Ku70的去乙酰化修饰可增强Ku70的活性，并增强其介导的DNA修复[13]。LIU等[14]研究发现，从衰老个体分离的成纤维细胞DNA中Ku70的表达水平显著降低。另一项研究中，DNA损伤可导致哮喘小鼠模型中气道上皮细胞的Ku70表达下降，这表明Ku70蛋白可能通过稳定细胞器功能来减少细胞死亡，其表达降低与哮喘患者气道上皮的线粒体和内质网细胞器障碍相关[15]。在BE中，Ku70的减少加剧了气道上皮的损伤和功能障碍，进而促进了炎症和病理进展。

在BE中，p21的高表达标志着气道上皮细胞的衰老和功能障碍。有研究发现，通过转基因方法每月清除衰老小鼠中高表达p21的衰老细胞，能显著延长其寿命和健康期[16]。有研究进一步指出，通过调控p53/p21信号通路抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞衰老抗肺纤维化，显著降低肺纤维化模型中p21的表达，减轻Ⅱ型肺泡上皮细胞的衰老，从而有效降低炎症反应，改善了肺纤维化[17]。这提示了p21在BE中的表达增加可能通过促进细胞周期停滞进而加剧气道炎症和结构损伤。

此外，本研究中ROC曲线分析结果显示，衰老标记物Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA诊断BE的AUC均超过0.600，均有较好的诊断价值。既往研究发现，Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在诊断牙周炎合并2型糖尿病、支气管哮喘等疾病中同样发挥一定应用价值[18-19]。这些发现进一步证实了衰老标记物在不同炎症性疾病中的潜在诊断作用，强调了其作为生物标志物的广泛适用性。

综上，在BE患者中，Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的表达量较对照组低，而p21 mRNA的表达量则较高。且随着BE病情的加重，Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA表达进一步下降，p21 mRNA表达上升，与疾病的严重程度相关，且均对BE病情具有良好的诊断价值。但研究受限于样本量和横断面设计，难以推广结果或确定因果关系，未来需扩大样本，采用纵向研究以深入分析。

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