补肾活血方中lncRNA00667的分子作用与绝经后膀胱过度活动症的关系研究

【摘要】目的 通过揭示lncRNA00667在补肾活血方治疗绝经后膀胱过度活动症（OAB）中的作用和相关机制，以期为全面和深入认识OAB的分子遗传学特征提供实验研究依据。方法 选择30只C57BL/6J大鼠（雌），随机选取其中10只作为假手术组，另外20只经切割卵巢构建OAB模型，建模成功后随机分成补肾活血方组和生理盐水组，各10只，3组大鼠术后均常规饲喂1周。术后1周补肾活血方组、生理盐水组分别灌胃补肾活血方与等量生理盐水，干预12周。记录3组大鼠每天的排尿量、排尿间隔时间及排尿次数；处死

3组大鼠，比较3组大鼠体质量、膀胱称重及脏器指数；取大鼠血浆、膀胱上皮细胞检测lncRNA00667基因表达情况。结果 假手术组大鼠体质量和膀胱称重均高于生理盐水组和补肾活血方组，且补肾活血方组的体质量高于生理盐水组（均P<0.05），生理盐水和补肾活血方组大鼠膀胱称重，以及3组大鼠间膀胱脏器指数比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）；假手术组大鼠每次尿量、排尿次数均少于生理盐水组和补肾活血方组，且补肾活血方组每次尿量少于生理盐水组，假手术组排尿间隔时间长于生理盐水组（均P<0.05），生理盐水组和补肾活血方组排尿次数和排尿间隔时间比较，以及补肾活血方组和假手术组排尿间隔时间比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）；假手术组大鼠血浆和膀胱平滑肌的lncRNA00667表达量均高于生理盐水组和补肾活血方组，且补肾活血方组大鼠血浆lncRNA00667的表达均高于生理盐水组（均P<0.05），但补肾活血方组和生理盐水组大鼠膀胱平滑肌中lncRNA00667的表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 采用补肾活血方对绝经后OAB大鼠模型进行干预，可提高lncRNA00667表达水平，改善大鼠排尿活动，促进体质量的恢复，从而获得较好的效果。

【关键词】膀胱过度活动症 ; 补肾活血方 ; lncRNA00667 ; 分子功能

【中图分类号】R694 【文献标识码】A 【文章编号】2096-3718.2024.23.0030.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.23.010

膀胱过度活动症（overactive bladder， OAB）作为临床上的一种常见病、多发病，其常见症状有尿急、尿失禁、夜尿增多及尿频等，且该病具有病程长、迁延不愈的特点，不仅危害患者身心健康，在一定程度上还加重了患者的精神和生理负担。OAB是老年妇女常见病，考虑可能与绝经后女性雌激素水平降低，从而促使膀胱颈周围致密弹力纤维组织、膀胱颈腺体及其导管变薄，导致疾病的发生有关。对于OAB患者，临床上以对症治疗为主，雌激素替代治疗是预防OAB和绝经后综合征的主要方法。但内分泌替代疗法会产生严重的心、血管、肝脏等不良反应，以及增加子宫内膜癌的发生风险。因此寻找和研发OAB的更有效的治疗方法和手段是临床研究的重点。一般来说，大部分疾病的发生、发展是一个多基因改变、多步骤演进的复杂过程，目前有许多基因如miR-139-5p、miR-98-5p、Arg已被证实与OAB的发生、发展和预后密切相关，并有望成为OAB新的分子标记物和治疗靶点[1]。有研究指出，在生物调控中，蛋白质作为一种执行元件，其中长链非编码核糖核酸

（lncRNA）与蛋白质通过互相作用，可以作用于生物调控。lncRNA对基因表达进行调控的方法较多，并且呈现出多样化的特点[2]。lncRNA00667作为lncRNA家族的一员，在绝经后机体表达上调后，lncRNA00667可使雌激素水平增加，改善内分泌，使肌肉收缩力下降，对逼尿肌收缩进行抑制，从而达到缓解疾病症状的目的[3]。对于绝经后OAB，中医经典著作中并没有相关论述，但是以其病证分析和症状表现特点为基本依据，可以将其划分为“小便不禁”“遗尿”“小便频数”“淋症”等范畴，认为其病机病因是命门火衰、肾气亏虚，膀胱气化无力，早期以湿热入侵机体在下焦中聚集，或气机阻滞、情志不舒，阻碍气血正常运行，使“瘀”“热”“湿”互结，对膀胱气化功能产生影响，久至肝、肾、脾亏虚，本虚标实，加剧气化不利，所以治疗应遵循补肾益气、活血化瘀的基本原则[4]。补肾活血方作为中医的一个经验方，方中枸杞、熟地黄可以平补肾中阴阳以益肾气，独活、没药、山茱萸及杜仲等具有消瘀散结、活血化瘀的功效，与归尾、补骨脂等合用，不仅可以活血破瘀，还能养血生新，全方共奏活血补肾的功效[5]。基于此，本研究旨在探讨lncRNA00667在绝经后OAB采用补肾活血方治疗中的分子功能与作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择C57BL/6J雌性大鼠30只，体质量200～220 g，3月龄，SPF级喂养5～7 d以适应环境，观察无不良反应后，纳入实验。所有大鼠均是来自南方医科大学附属广东省人民医院（广东省医学科学院）医学实验动物中心的SPF级动物，动物许可证编号：SCXK（粤）2022-0002。

1.2 主要仪器和试剂 主要仪器：水套式二氧化碳培养箱[上海一恒科技有限公司，型号：BPN-80CW（UV）]，荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测系统（杭州博日科技股份有限公司，型号：FQD-96A），DNA序列分析电泳仪（上海艾研生物科技有限公司，型号：Mini-SUB Cell），凝胶成像系统（美国伯乐生物科技有限公司，型号：ChemiDoc MP），倒置荧光显微镜（奥林巴斯株式会社，型号：IX73），化学发光凝胶成像系统[孚约生物科技（上海）有限公司，型号：ChemiDoc]等。

主要试剂：100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基和DMEM培养基，10%胎牛血清（上海劲马生物科技有限公司）；高容量cDNA反转录试剂盒[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]等。

1.3 绝经后OAB大鼠模型构建与分组 选择30只C57BL/6J雌性大鼠，随机选取其中10只健康、体质量相似的大鼠作为假手术组，接受与实验组相同的手术操作，但未切除目标器官；另外20只切割卵巢构建绝经后OAB大鼠模型，建模成功后随机分为两组，每组10只，分别是补肾活血方组和生理盐水组，确保3组大鼠在术后体质量和活动能力正常，无术后异常反应表明建模成功，常规饲喂1周。术后1周，补肾活血方组灌胃补肾活血方，根据1 mL/（100 g·d）体质量给予补肾活血方（熟地黄、肉苁蓉各20 g，补骨脂、菟丝子、山茱萸各15 g，杜仲、枸杞、归尾、没药、独活各10 g组成，冷水煎煮药材，取汁100 mL，含生药量1.35 g/mL）灌胃，控制时间在3 min；而生理盐水组于术后1周给予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续干预12周。

1.4 研究方法

1.4.1 排尿活动测定 采用代谢笼法，即在简易代谢笼内放入大鼠，通过笼底部的大小便分离漏斗分开粪便与尿液，对尿液进行采集，并且记录每天的排尿量、排尿间隔时间及排尿次数，持续30 d，计算平均值。

1.4.2 lncRNA00667基因表达水平检测 干预12周后，通过切尾采血的方法进行全血采集，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂，然后放入离心管中，以3 000 r/min转速进行10 min离心处理后取上层血浆。膀胱平滑肌标本制备：在无菌条件下，通过手术解剖取大鼠膀胱组织，运用磷酸盐缓冲液对膀胱组织进行清洗后，将杂质和血液去除，然后在低温条件下，运用解剖刀对膀胱平滑肌层进行分离，操作时尽量避免对组织造成损伤，完成操作后，在液氮中冷冻组织。采用高容量cDNA反转录试剂盒将核糖核酸（RNA）逆转录为互补cDNA，将20 μL RNA应用于整个反应体系中。具体条件：95 °C条件下进行30 s变性后，56 °C条件下进行45 s退火，72 °C条件下进行45 s延伸，再根据荧光定量PCR检测系统针对PCR反应循环35个，运用生物系统TaqMan微小RNA检测试剂盒[赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供]方案进行逆转录后检测lncRNA00667水平，其中lncRNA00667的正向引物序列为5’-CGACCCCAACACCTTCTTTG-3’，反向引物序列为5’-CTCACCCTAAGTTCGCTGG-3’。

1.4.3 体质量、膀胱称重及脏器指数 在结束实验后对大鼠进行称重，然后通过颈椎脱臼法处死后取膀胱，分别称取总量；对膀胱脏器指数进行计算，即膀胱脏器指数=膀胱脏器质量（mg）/大鼠体质量（mg）×1 000，计算出每只实验动物的膀胱脏器指数，并记录各组数据。

1.5 观察指标 ⑴比较3组大鼠的体质量、膀胱称重及脏器指数；⑵比较3组大鼠的排尿活动，包括每次尿量、排尿次数、排尿间隔时间；⑶比较3组大鼠血浆和膀胱平滑肌组织中lncRNA00667基因表达水平。

1.6 统计学方法 运用SPSS 20.0统计学软件分析数据，计量资料均使用S-W法检验证实服从正态分布，以（ x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠体质量、膀胱称重及脏器指数比较 假手术组大鼠体质量和膀胱称重均高于生理盐水组和补肾活血方组，且补肾活血方组的体质量高于生理盐水组，差异均有统计学意义（均P<0.05），生理盐水和补肾活血方组大鼠膀胱称重，以及3组大鼠间膀胱脏器指数比较，差异均无统计学意义（均P>0.05），见表1。

2.2 3组大鼠的排尿活动情况比较 假手术组大鼠每次尿量、排尿次数均少于生理盐水组和补肾活血方组，且补肾活血方组每次尿量少于生理盐水组；假手术组排尿间隔时间长于生理盐水组，差异均有统计学意义（均P<0.05），生理盐水组和补肾活血方组排尿次数和排尿间隔时间比较，以及补肾活血方组和假手术组排尿间隔时间比较，差异均无统计学意义（均P>0.05），见表2。

2.3 3组大鼠血浆和膀胱平滑肌lncRNA00667水平比较 假手术组大鼠血浆和膀胱平滑肌的lncRNA00667表达量均高于生理盐水组和补肾活血方组，且补肾活血方组大鼠血浆lncRNA00667表达量均高于生理盐水组，差异均有统计学意义（均P<0.05），而补肾活血方组和生理盐水组小数膀胱平滑肌中lncRNA00667表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

3 讨论

目前，关于OAB的发生机制，当前学说较多如肌源性、神经激肽、神经源性及膀胱上皮屏障等，其是多种因素相互作用的结果。因此，深入探究OAB的发生机制，且对具有特异性和不良反应较小的药物进行开发是OAB治疗的一个重要方向。

OAB基本病机包括膀胱气化功能失常、肾虚、湿热蕴结，作为一种本虚标实之证，以膀胱湿热和肾虚为主，所以治疗原则是“虚则补之，实则泻之”。《伤科大成》为补肾活血方的主要出处，方中杜仲、熟地黄、山茱萸、枸杞子、肉苁蓉、补骨脂及菟丝子等可以强筋壮骨、温补肾阳；辅以没药、独活、归尾可以温肾补阳、填补精血、止痛通络、祛瘀活血，全方共奏止痛、活血养血、壮筋补肾的功效。

由于女性泌尿生殖系统来源于胚胎原始生殖窦，共为雌激素依赖的器官，在生长发育中受雌激素影响，因此雌激素不足必然会对下尿路结构产生影响。绝经期女性卵巢功能逐渐减退，内分泌功能失调，减少体内雌激素分泌，使下丘脑功能和自主神经系统失调，再加上雌激素水平下降，促使平滑肌对神经刺激应答性下降，引起膀胱平滑肌收缩无力，同时引起膀胱尿道黏膜血流供应减少，导致黏膜萎缩，弹性纤维变薄，从而诱发膀胱上皮萎缩性改变，出现尿频、尿急等尿路功能障碍症状。本次研究结果显示，假手术组大鼠每次尿量、排尿次数均少于生理盐水组和补肾活血方组，且补肾活血方组每次尿量少于生理盐水组，假手术组排尿间隔时间长于生理盐水组，这表明补肾活血方能够改善OAB大鼠临床症状。经现代药理学研究表明，山茱萸中环烯醚萜苷可以抗血小板聚集，使血浆黏稠度下降，对膀胱尿道黏膜血流供应血液循环起到一定的促进作用，使组织器官的生理功能维持正常，从而改善尿路功能障碍症状[6]；肉苁蓉中的肉苁蓉总苷、苯丙醇糖等能够改善下丘脑 - 垂体 - 性腺轴平衡失调，以促性腺激素释放激素、性激素、促性腺激素释放，从而促进阴道和尿道上皮细胞成熟，增加尿道平滑肌α肾上腺素能受体的敏感性，使尿道平滑肌收缩，从而增强大鼠排尿控制能力，可使尿液的不自主排泄减少，改善排尿功能[7]。

在本次研究中，为了更全面分析补肾活血方的作用，各组大鼠结束实验后称重，结果显示，假手术组大鼠体质量和膀胱称重均高于生理盐水组和补肾活血方组，且补肾活血方组的体质量高于生理盐水组，这提示采取补肾活血方治疗能够促进切割卵巢大鼠的体质量恢复。分析其原因为，补肾活血方中含有的没药、归尾等中药成分能活血养血，对切割卵巢的大鼠切口抗炎和促进血液循环，并增强体质和免疫功能，从而促进身体恢复，进而促进体质量恢复[8]。

lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，其序列元件处于高度保守状态，空间二级结构比较特殊，亚细胞定位明确，还有细胞或者组织表达特异性，说明在细胞总转录物种，这些所占比例较高。lncRNA虽然缺乏蛋白质编码能力，但其生物学功能比较重要，在基因表达调控中发挥着重要作用。研究发现，在绝经后OAB患者中，lncRNA00667表达上升后，可增强细胞间兴奋传递功能，并且OAB患者膀胱逼尿肌lncRNA00667表达和功能明显增加[9]。本次研究显示，采用补肾活血方治疗后，其血浆和膀胱平滑肌中的lncRNA00667水平均升高，说明补肾活血方能够使OAB大鼠血浆中的lncRNA00667水平升高，从而达到对OAB进行抑制的效果。分析其原因为，方中杜仲、熟地黄、山茱萸、补骨脂及菟丝子等合用，能够利用抗氧化应激功效，将自由基清除，抑制细胞凋亡，使细胞免疫功能增强，对激素平衡进行调节，并且还能增强下丘脑 - 垂体 - 性腺轴功能，升高lncRNA00667水平，使雌激素水平增加，改善内分泌，使肌肉收缩力下降，对逼尿肌收缩进行抑制，从而达到治疗目的[10]。

综上，采用补肾活血方对绝经后OAB大鼠模型进行干预，可提高lncRNA00667表达水平，改善大鼠排尿活动，促进体质量的恢复，从而获得较好的效果。但是方中是何种成分在治疗中起到主导作用，未来还需进一步探索。

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