核糖体蛋白L5 在Diamond-Blackfan 贫血伴发唇腭裂中作用机制的研究进展

[摘要] 核糖体蛋白L5 （RPL5） 是核糖体大亚基的一部分，携带RPL5 基因突变的Diamond-Blackfan 贫血患者会伴发多种畸形，包括唇腭裂等颅面畸形以及心脏缺陷等躯体畸形。但是在RPL5 突变导致核糖体生物发生缺陷的情况下，唇腭裂发生的机制仍然知之甚少。本文综述了近年对于RPL5 的研究，并讨论了突变的RPL5 核糖体蛋白与唇腭裂发生的可能机制。

[关键词] 核糖体蛋白L5； Diamond-Blackfan 贫血； 唇腭裂； P53； 核糖体蛋白

[中图分类号] Q75 [文献标志码] A [doi] 10.7518/gjkq.2024092

Diamond-Blackfan 贫血（Diamond-Blackfananemia，DBA） 是一种以红细胞再生障碍为主要特征的遗传性骨髓衰竭综合征，OMIM数据库编号为105650，其主要特征是红细胞贫血并发颅面、上肢、心脏和泌尿系统先天畸形。它是核糖体疾病的模型，与小或大核糖体亚基的20个核糖体蛋白基因中的1个杂合等位基因变异有关[1]。核糖体是由核糖体RNA （ribosomal RNA，rRNA） 和核糖体蛋白（ribosomal protein，RP） 组成的核糖核蛋白复合物，rRNA和RP组成40S和60S 2个不同大小的核糖体亚基，2个亚基按照特定顺序进行分层组装最终形成成熟的核糖体，负责翻译信使RNA（messenger RNA，mRNA） 中的遗传密码，并催化所有细胞中的蛋白质合成[2]。核糖体曾经被认为是相对稳定的实体，然而，随着在DBA综合征中发现核糖体蛋白基因的突变，RP突变可能导致复杂、可变和可存活的表型。值得注意的是，携带核糖体蛋白L5 （ribosomal protein L5，RPL5） 基因突变的DBA患者会伴发多种畸形，包括唇裂和/或腭裂或软腭裂，孤立或与其他面部畸形伴发（例如小颌畸形、眼距过宽或下颌发育不全伴颌后畸形）、拇指和心脏异常[3-5]。2005年DBA登记处的数据显示，5.7%的DBA患者伴发唇裂和/或腭裂[6]，而相比之下，在一般人群中，唇腭裂（cleft lip andpalate，CLP） 的发生率为0.1%～0.2%[7]。2010年的一份研究[8]发现，4例RPL5突变的日本患者有3例出现躯体畸形，2例出现腭裂，而45例无RPL5突变的患者中只有1例出现腭裂，这表明DBA患者的CLP畸形与RPL5突变密切相关。

1 RPL5 基因结构和突变

RPL5基因位于染色体1p22.1，共包含8个外显子，跨度为9.8 kb，初级转录本长1 031 nt，编码60S核糖体亚基中的297-aa蛋白组分（相对分子质量2 600）。作为DBA患者伴发CLP的主要致病基因，其已经被报道了多种杂合突变[3-5]，目前已发现的突变种类包括无义突变、小片段缺失或插入突变，以及剪接位点突变等，所有已鉴定的突变都是杂合的，纯合的突变被认为是致命的。产生点突变的常见诱变机制包括滑移（导致碱基插入/缺失） 和胞嘧啶-鸟嘌呤（cytosine-guanine，CpG）二核苷酸甲基化，然后自发脱氨，导致Ggt;A或Cgt;T转变[9]。

2 RPL5 基因功能和生物学致病性

RPL5基因编码一种相对分子质量34 000的核糖体大亚基蛋白，是核糖体的重要组分之一，它参与核糖体的生物发生，可以和rRNA结合形成核糖体行使蛋白质合成的功能。除了参与基础翻译机制的组装外，RPL5还在细胞中发挥独立于核糖体之外的功能，称为核糖体外功能[10]，包括调控细胞增殖、凋亡、分化和调控基因表达等。

2.1 RPL5 的核糖体生物发生功能

核糖体的生物发生是指核糖体形成和成熟的过程，包括rRNA的合成、修饰以及蛋白质组装等多个步骤，它和蛋白质合成是细胞持续生长所必需的关键过程[11]。细胞生长和分裂是任何多细胞生物发育的基础，在胚胎发生过程中，每个生长和分裂细胞都需要足够数量的核糖体来应对翻译和合成蛋白质的需求。这种需求是由核糖体生物发生来保证的，RPL5与其他RP一样调节核糖体装配单位平衡，维持核糖体完整性，参与mRNA的翻译和蛋白质合成。RPL5基因突变会导致核糖体生物发生缺陷、mRNA翻译异常改变和蛋白质合成障碍。

2.2 RPL5 的核糖体外功能

RP是在每个细胞中都大量存在的RNA结合蛋白，近年来越来越多的研究表明，它们似乎会被招募来执行许多核糖体外辅助功能。Warner等[12]将RP的核糖体外功能分为：1） 核糖体内的体外功能，控制核糖体成分之间的平衡；2） 识别核仁应激或异常核糖体合成的核糖体外功能，导致细胞周期停滞或凋亡；3） 涉及RP的未被证明的特异性或非特异性效应。各种异常代谢状况、细胞毒性化合物和身体损伤会导致核仁结构和功能的改变，这种情况称为核仁或核糖体应激[13]。关于RPL5的核糖体外功能研究主要涉及其参与核糖体应激反应方面。

真核细胞内的核糖体装配过程非常复杂，涉及200多种蛋白质及不同RNA分子，各种原因所致的核糖体装配失衡，均会引发核糖体应激反应。RPL5的基因发生突变后引起RPL5蛋白单倍剂量不足，使得RPL5蛋白无法装配成正常核糖体大亚基，游离的RPL5在核仁内累积，它们离开核仁进入核质，结合并阻断鼠双微基因2 （murine doubleminute-2，MDM2）[14]。MDM2是一种泛素-蛋白质连接酶， 能够靶向降解抑癌因子P53，RPL5 与MDM2结合后，抑制其泛素连接酶的活性进而稳定P53，细胞内积聚的P53发挥细胞周期调控作用，介导细胞发生G1期细胞周期阻滞或凋亡。RPL5-MDM2-P53信号通路提供了一个分子开关，可以构成监测核糖体生物发生完整性的监视网络[15]。

此外，RPL5在组装成核糖体大亚基之前，还与5S rRNA的核胞质转运有关[16]，它具有模块化结构域结构，利用不同结构域介导5S rRNA结合和核仁定位：通过位于氨基末端的结构域，特异性地与5S rRNA结合，而位于羧基末端的结构域用于将蛋白质定位到核仁[17]。RPL5 与RPL11 和5SrRNA一起，形成了5S-核糖核蛋白复合物（ ribonucleoprotein，RNP）[18]，5S-RNP是一种核糖体组装中间体，在核糖体应激反应中调控MDM2-P53通路。核糖体功能障碍引起应激时，5S-RNP在核糖体内大量积累，过量的5S-RNP与MDM2结合并阻断由MDM2介导的P53泛素化和降解，导致P53依赖性细胞周期停滞。已有研究[19]表明，5S-RNP，而不是单个RPL5，结合并调节非应激细胞中的MDM2，当核糖体生成缺陷导致5S-RNP积累时，这种相互作用会增强。

2.3 RPL5 的生物学致病性

Gazda 等[4]在敲低RPL5 的细胞模型和携带RPL5突变的患者细胞中，发现了RPL5功能不全对核糖体生物发生的致病作用：表达针对RPL5的小干扰RNA （small interfering RNA， siRNA） 的HeLa细胞显示出28S和5.8S成熟rRNA的产生及其前体的积累减少，特别是32S和12S；此外，RPL5敲低诱导游离60S亚基的减少和半聚体多聚体的形成。Lin等[20]通过构建基因-蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPI） 网络，对目前已知与霉酚酸（mycophenolic acid，MPA） 诱导的CLP发病机制相关的基因进行了生物信息学分析，发现MPA诱导的CLP由多个核糖体应激相关基因和途径介导，而MDM2、RPL5和P53可能是这种发病机制的主要贡献者。

Schreiner等[21]敲低非洲爪蟾RPL5后，观察到颅软骨缺陷、眼睛畸形和小头畸形，且神经嵴、眼和脑的标记基因的表达降低。此外，RPL5敲低导致早期胚胎发育过程中细胞增殖减少和细胞凋亡增加，而注射细胞凋亡阻断剂B淋巴细胞瘤-2（B cell lymphoma-2，BCL2） 可减轻眼睛畸形，表明细胞凋亡是RPL5敲低时表型发生的主要原因之一。Fukui等[22]提取了RPL5突变的DBA患者的诱导多能干细胞，这些细胞保留了分化成骨细胞和软骨细胞的能力，而RPL5单倍体不足通过MDM2抑制P53介导的软骨细胞凋亡，从而导致DBA患者的身体异常。

RPL5在核糖体的生物发生和核糖体的应激反应的作用已明确，但在RPL5突变导致核糖体生物发生缺陷的情况下，如何导致CLP等颅面畸形的发生？其具体的机制仍有待探索。

3 RPL5 基因突变与CLP 的相关性

RPL5是第一个被发现与DBA患者唇裂和/或腭裂相关的核糖体蛋白基因。2008年Gazda等[4]通过对196个DBA家庭的RP基因进行测序， 发现RPL5 突变存在于整个DBA人群的6.6%， 其中RPL5的突变约70%与身体畸形相关；他们通过对20名RPL5突变患者的现有医学数据进行回顾，发现大多数患者（14/20） 有身体畸形，包括颅面、拇指和心脏异常，而14例RPL5突变和躯体异常的患者中有9例存在唇裂和/或腭裂或软腭裂，孤立或与其他面部畸形（例如小颌畸形、眼距过宽）和/或其他躯体异常（例如心脏或拇指异常）。2010年Quarello等[5]对所筛选的意大利DBA患者进行了基因型-表型分析，发现大多数RPL5 （83%）突变患者有身体畸形，还发现颅面异常与RPL5突变密切相关，在111名参与临床评估的患者中，观察到8位患有唇裂和/或腭裂，而这8位患者的RPL5都有突变。Boria等[9]通过对DBA突变数据库中报告的所有DBA患者的临床数据进行统计学分析，结果发现：RPL5突变患者发生多发性畸形的风险较高， 统计库中的24名CLP患者中有21名存在RPL5突变。

目前尚未在DBA外的非综合征型CLP患者中检测到RPL5基因的突变，在已建立的DBA动物模型中也未发现CLP等颅面畸形表型[23]。2016年，Kazerounian等[24]报告了敲除RPL5或RPS24的小鼠模型，杂合RPL5或RPS24小鼠出生正常，没有出现任何疾病迹象，包括贫血。2019年Kazerounian等[25]使用RNA干扰（RNA interference，RNAi） 方法构建了RPL5下调小鼠模型，这些小鼠的主要特征包括轻度贫血、网织红细胞减少症和骨髓成红细胞减少症。2021年Yu等[26]报告了内含子诱导的RPL5基因突变的小鼠模型，在RPL5新生小鼠中观察到大细胞性贫血和心脏缺陷。由于RPL5基因型与颅面畸形密切相关，他们最初广泛分析了小鼠的此类缺陷，然而目前无法通过组织学或显微计算机断层扫描找到颅面畸形的确凿证据。

此外，RPL5基因突变的外显率并不完全，修饰基因和环境因素作用可能会对RPL5的遗传性造成影响[27]，潜在的修饰基因可能是参与调节RP基因表达水平的基因或参与核糖体生物发生的其他基因，启动子或其他区域的变异也被假设为表型修饰剂。

4 RPL5 基因突变引发CLP 的可能机制

RPL5基因突变会引发DBA患者并发CLP等严重的颅面畸形，其相关机制已成为研究热点但尚未阐明，可能有以下几种机制。

4.1 P53 依赖性途径

RP缺乏会导致发育过程中出现复杂的表型，从突变致死性到发育异常到贫血，再到细胞增殖、迁移改变到肿瘤发生，这些可变结果可能源于RP单倍体不足的双重影响：核糖体不足导致的翻译效率低下和翻译产物改变；以及由RP缺乏引起的核糖体应激反应激活。P53是细胞命运的主要调节因子[28]，它被核糖体应激反应激活后，会反式激活一组抑制细胞周期进程、促进DNA修复、诱导细胞凋亡或自噬的靶基因。目前已经产生了几种DBA和5q综合征的小鼠模型，证实了P53通路通过核糖体功能障碍被激活，例如，在仅缺失RPS6的一个等位基因的小鼠模型上，观察到核糖体的生物发生受损，但其早期胚胎致死是由于P53依赖性细胞周期阻滞和凋亡的激活，而不是由于mRNA翻译的普遍下调[29]。

感应核糖体应激反应导致P53激活的机制现在已经明确：RPL11和RPL5，在核糖体生物发生受损的情况下，激活P53依赖的细胞周期阻滞、衰老或凋亡。前文已经提到，RPL5基因突变导致其单倍剂量不足， 使得游离的RPL5 进入细胞质与MDM2结合激活P53，此外，RPL5还作为5S-RNP的关键组分调控P53，当核糖体生物发生被阻断时， 5S-RNP 从组装到60S 核糖体重新定向到MDM2 E3连接酶，抑制MDM2从而激活P53。5SRNP现已成为细胞生长和增殖控制界面信号通路的关键调控因子，5S-RNP-MDM2复合物已成为掌控P53的中枢变阻器，除此，P53也会受到其他一些5S-RNP调节因子的影响[30]。

核糖体蛋白不足触发P53活化，表明P53可能参与介导人类核糖体病的一些表型表现，作为5SRNP的关键组分和MDM2的结合蛋白，RPL5基因突变导致的CLP等多种颅面畸形也可能与P53的激活密切相关。

4.2 P53 非依赖性途径

P53活性增加参与介导了人类核糖体病的发生，但在DBA的动物模型中，同时敲除P53的2个等位基因仅部分挽救了发育缺陷，这表明P53介导部分但不是全部表型，可能有其他信号分子也参与了核仁应激反应[31]。维持适当的核仁结构和基因组稳定性可能是另一个潜在的机制，特定的RPL与核仁组装和功能密切相关。研究[32]表明，RPL5在核仁空间定位和浓缩核仁中核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA） 阵列的染色体位点方面起作用，并促进rRNA转录和加工。同时核仁在某些异染色质富集的染色体结构域中起着重要作用，其结构完整性和异染色质的空间定位是相互依赖的[33]。核糖体生物发生和染色质组织之间存在良好的平衡，在RPL5缺失的细胞中，核仁组装受损、其周围的异染色质结构被破坏，这可能使细胞易发生基因组不稳定和DNA损伤。

氧化应激在核糖体病发病机制中的重要性正日益得到认可，在RPL5和RPS19缺乏的小鼠DBA细胞中，检测到活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水平升高[34]。有研究[35]通过抗氧化处理降低ROS水平后发现，RPL10突变细胞的生长缺陷发生了好转，证实了氧化应激与核糖体缺陷之间的紧密联系。自噬可能是一种相对常见的细胞对RP丢失的反应，它可以以细胞特异性的方式，依赖或独立于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和P53发生[36]。此外，在核糖体生物发生缺陷的细胞中还发现了其他与P53无关的效应，例如E2F1转录因子的定向降解，E2F1作为一种多功能蛋白质，可以将许多相同的染色质修饰酶募集到DNA损伤位点以促进修复[37]。

P53非依赖性的核糖体生物发生效应也很重要，RPL5基因突变导致的P53激活，可能与上述独立于P53的核仁应激反应共同作用，导致发育缺陷表型的发生。

4.3 mRNA翻译的异常改变

RP缺乏会导致基因表达的显著变化，每种RP的影响程度不同。Luan等[38]在用特定的siRNA抑制单个RP之后，通过对RP进行转录组测序、翻译组测序以及相关表型观察后发现，在大多数情况下，RP敲低后翻译的变化比转录更显著。RPL5突变导致的核糖体合成和功能的缺陷，极大地影响了核糖体的翻译能力和效率[39]。核糖体病细胞模型的全基因组翻译分析表明，在功能性核糖体的可用性有限的情况下，mRNA的翻译，特别是编码参与细胞命运决策的蛋白质的mRNA，会受到更大的损害[40]。目前已经提出了2个假设以解释选择性mRNA翻译在疾病发病中的作用机制，包括“异质核糖体”假说和“核糖体浓度”假说[41]。异质核糖体假说认为，rRNA序列、核糖体蛋白或核糖体相关蛋白的变化，可导致与mRNA差异作用的异质核糖体生成，从而导致特定mRNA的优先翻译[42]。而核糖体浓度假说认为，数量有限的功能性核糖体可能引起mRNA之间对核糖体的竞争，从而导致mRNA翻译效率的变化[43]。

除了上述2种解释以外，另一种解释核糖体合成或功能缺陷如何影响mRNA翻译并可能导致细胞转化的假设，是关于mRNA翻译模式的改变[44]。核糖体蛋白的活性和水平的变化，会对mRNA的翻译产生高度特异性的影响，具体而言，翻译本身分为4个阶段：起始、伸长、终止和回收。核糖体的翻译过程可以根据它们对翻译因子的相对亲和力，改变其起始和延伸之间的比例，从而对各种mRNA产生不同的影响。核糖体蛋白缺乏，可能改变了翻译起始和延伸之间的比例，进而影响相关蛋白合成的翻译模式。核糖体数量的减少，可能导致难以翻译的mRNA选择性翻译减少，而其他mRNA翻译增多。mRNA翻译的减少，也可能导致DNA复制和修复因子以及组蛋白的缺乏，从而可能导致基因组不稳定。

综上，RPL5致病的主要机制是：当RPL5基因突变后，通过RPL5-MDM2-P53和5S-RNP-MDM2-P53环路激活P53，引发细胞周期停滞及细胞凋亡，在此过程中，P53非依赖性核糖体的生物发生效应以及mRNA翻译的改变也发挥了相应作用，共同引发CLP等颅面畸形。

5 展望

核糖体生物发生和蛋白质合成是细胞生长和增殖的关键步骤，RPL5作为核糖体的结构组成部分，对核糖体的组装和功能至关重要。除了其规范的核糖体功能外，RPL5还具有核糖体外功能，包括响应核糖体应激激活P53依赖性或P53非依赖性途径，导致细胞周期停滞和凋亡。此外，由于翻译能力和保真度受损，RPL5突变导致的核糖体生物发生的缺陷，也会进一步导致mRNA翻译模式改变，氧化应激和其他代谢变化，会加剧核糖体应激并诱导DNA损伤，促进继发突变和基因组不稳定，这些也可能导致与RPL5突变产生相关的表型。

虽然作为核糖体构成组分的RPL5广泛存在于机体的每一个细胞中，但是为什么携带RPL5基因突变的DBA患者更易表现出CLP等严重的颅面畸形表型？有人提出，RP单倍体不足所引发的核糖体应激反应似乎具有一定的组织甚至细胞特异性，并且提出了几种可能机制来阐明这种组织特异性现象。最简单和最直接的解释可能是每种RP的剂量需求，以维持不同细胞类型中的正常生理事件，例如核糖体生物发生、P53调节和其他细胞过程；另一种可能的机制是核糖体的核糖体成分在不同的细胞类型中可能有所不同。而最近的研究发现，应对P53 激活的特定细胞和/或组织环境中的mRNA异常翻译，可能有助于核糖体病的组织特异性表型，对响应RP突变和受损核糖体生物发生的mRNA翻译、基因突变和代谢改变的变化进行系统和全面的分析，将能够识别RP突变相关疾病的新突破点。

从对核糖体病变的研究来看，核糖体生物发生受损被认为是多种疾病发生的危险因素。Treacher Collins综合征、RPL5突变的DBA综合征等，越来越多与核糖体病变相关的颅面畸形正在不断被发现中，未来，关于核糖体蛋白参与相关的分子通路的研究会越来越深入，对RPL5突变导致CLP的致病机制的阐明，将为CLP等颅面畸形的预防奠定良好的基础。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。

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（ 本文编辑 张玉楠 ）

[基金项目] 四川大学华西口腔医院交叉项目（RD-03-202301）