新型氮肥对玉米根际土壤固氮微生物群落的影响

摘要：为探究长期施用新型氮肥对玉米连作体系根际土壤固氮微生物（nifH基因）群落的影响，采集长期定位试验（2014年始）玉米吐丝期根际土壤样品，以不施氮肥（NO）为对照，分析同常规尿素（CU）相比，3种新型氮肥[控释尿素（SU）、稳定性肥料（SF）、硫包衣尿素（SCU）]的施用对土壤固氮微生物群落的影响差异。结果表明：不施氮肥处理的固氮微生物nifH基因丰度高于施氮肥处理，不同氮肥处理中，稳定性肥料处理的固氮微生物nifH基因丰度（3.4x10 copies·g-1）显著低于其他处理，pH（相对影响值为44.51％）和有机质（相对影响值为35.01％）是影响固氮微生物nifH基因丰度的主要因素。与不施氮肥相比，氮肥施用降低了固氮微生物nifH基因的丰富度及多样性，与常规尿素处理相比，新型氮肥提高了nifH基因的丰富度指数但降低了多样性指数。固氮微生物nifH基因属水平主导物种为Desulfovibrio（相对丰度为14.11％-33.39％）、Stenotrophomonas（相对丰度为2.66％-17.72％）和Bradyrhizobium（相对丰度为2.68％-6.32％）。是否施氮对土壤固氮微生物群落结构的变化有显著影响（P=0.001），但施用不同新型氮肥处理与常规尿素相比对群落结构变化无显著影响（P=0.1）。研究表明，施用新型氮肥提高了固氮微生物nifH基因丰富度，改变了固氮微生物的群落结构。

关键词：新型氮肥；玉米根际土壤；固氮微生物nifH基因；群落结构

中图分类号：S513；S154.3 文献标志码：A 文章编号：1672-2043（2024）02-0360-08 doi：10.11654/jaes.2023-0251

东北黑土区是我国最重要的商品粮主产区，近年来国家供给侧改革政策的提出虽然导致玉米的种植面积减少，但作为主要粮食作物的玉米仍大面积连年种植。种植结构单一、化肥过量施用与肥料利用率较低均会导致土壤肥力下降、有机质含量降低及土壤养分失衡。因此，优化施肥结构、调整施肥方式、提高肥料利用率，对于保护黑土资源和保障国家粮食安全具有重要作用。

研究发现，我国氮肥的当季利用率仅为30％-35％，这在造成资源大量浪费的同时降低了玉米的产量和品质。控释氮肥能够调控氮素释放时间以满足作物生育期内的养分需求；稳定性肥料是指在生产过程中加入硝化抑制剂或脲酶抑制剂或两者同时加入，通过降低尿素在土壤中的水解速度来降低铵态氮的硝化和反硝化作用，最终达到肥料氮素缓慢释放和减少氮素损失的一类肥料；硫包衣尿素（以硫磺为主要包膜材料）可在补充硫和氮素的同时缓释养分。新型氮肥具有肥效长、释放稳定、改善土壤质量等特点，新型氮肥的施用能够减少肥料浪费和环境污染，提高氮肥利用效率。

新型氮肥在玉米中的施用效果研究较多，主要集中在作物产量、土壤物理化学性质、土壤酶活性、环境效应、土壤细菌及真菌群落结构的变化。在生物固氮的过程中，固氮菌能够与氮气结合，将不可吸收利用的氮气转化为铵态氮进而被植物吸收利用，因此对土壤氮循环起着至关重要的作用。而关于新型氮肥施用下土壤固氮微生物群落结构及多样性的变化鲜有报道。研究表明，固氮菌群落的丰度、多样性和组成是决定土壤固氮能力的关键生物学因素，固氮菌群落受到土壤中各种生物和非生物因素的影响，包括肥料、土壤养分、耕作制度等。根际是土壤与作物进行物质能量交换的重要场所，植物通过根系分泌物来影响土壤理化性质，其影响最先反映在根际土壤上，因此本研究在玉米连作体系下，以固氮微生物nifH基因作为固氮菌的指示基因，利用高通量测序技术，分析3种新型氮肥（控释尿素、硫包衣尿素、稳定性肥料）对玉米根际土壤固氮细菌群落结构及多样性的影响，并分析其与土壤养分之间的关系，以期为该地区高效施氮的推广应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验地概况

长期定位试验始于2014年，试验设置在吉林省梨树县中国农业大学梨树试验站（43°16′43.6″N，124°26′ 9.5″E）。该地区属温带半湿润大陆性季风气候，全年降水主要集中在6-8月，年平均气温为6.8℃，年均降水量为614 mm。供试土壤类型为薄层黑土，基本理化性质如下：pH 5.74、有机质含量为18.9 g·kg-1、碱解氮含量为87.5 mg·kg-1、速效磷含量为18.5 mg·kg-1、速效钾含量为186.3 mg·kg-1。

1.2试验设计

试验设置5个处理：①不施氮肥（NO）；②常规尿素（CU）；③控释尿素（SU）；④稳定性肥料（SF）；⑤硫包衣尿素（SCU）。其中常规尿素采用28-11-11复合肥（中化化肥控股有限公司），控释尿素为树脂包裹的高分子无机肥料（中国-阿拉伯化肥有限公司），稳定性肥料为同时添加脲酶和硝化抑制剂的肥料（中国-阿拉伯化肥有限公司），硫包衣控释肥为硫磺包裹的无机肥料（上海汉枫集团），上述氮肥施用量均为224kg·hm-2（以N计）。所有处理磷、钾肥料施用量完全相同（P2O5 88 kg·hm-2，K2O 88 kg·hm-2），磷肥为磷酸二铵（P2O5 46％，N 18％），钾肥采用氯化钾（K2O60％），所有肥料作为基肥在播前一次性施入。每个处理3次重复，共15个小区，完全随机区组排列，小区面积为40 m2（宽3.6 m、长11.1 m）。试验地为玉米连作，每年5月初播种，10月初收获，供试玉米品种为良玉99，种植密度为65 000株·hm-2。

1.3土壤样品采集及测定项目

土壤样品采集于2021年7月玉米吐丝期，取样器具经灭菌处理，采用抖根法收集根际土壤样品。每个试验小区均匀选取3个点，迅速去除可见动植物残体及石块等，将3个点的土壤样本过2 mm孔径无菌网筛后混合均匀并作为1个土壤样品，取5-10 g土样装入无菌管中，带回实验室-80℃保存，用于微生物提取，剩余土壤样品4℃冷藏保存，用于土壤基本理化性质的测定。土壤pH（土水比1：2.5）采用电位法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定；速效钾采用NH4OAc浸提、火焰光度计法测定；速效磷采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色、分光光度计法测定；有机质采用重铬酸钾外加热法测定。

1.4土壤DNA提取及实时荧光定量PCR

微生物组DNA提取方法参照PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories，Carlsbad，CA）[Omega Stool DNA Kit]试剂盒说明书。提取得到的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳和分光光度法进行DNA质量和浓度的检测，质检合格后进行PCR扩增，引物为5’-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3’和5’-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3’。采用绝对定量PCR检测技术，检测固氮微生物nifH基因数量。

1.5数据分析

采用Excel 2019软件进行数据处理，SPSS 25软件进行数据分析。土壤性质对nihH基因丰度的相对影响通过使用gbm包进行聚合增强树分析（ABT）进行定量估计，其中500棵树用于增强，5折交叉验证估计误差；基于R（4.2.2）中vegan包计算细菌群落Shannon和Chaol指数；根据分类学分析结果，可以得知不同样本在各分类水平（如域、界、门、纲、目、科、属、种、OTU等）上的物种组成情况，利用R（4.2.2）软件制图；使用RColorBrewer包基于Bray-Curtis距离计算并绘制非度量多维排列分析（Multidimensional scaling，NMDS）和组间差异分析（Analysis of similarities，ANOSIM）图；同时利用置换多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）评估氮肥施用和肥料类型对固氮微生物nifH基因多样性（Alpha多样性指数）和结构（OTU丰度）的影响，利用R（4.2.2）软件完成。

2结果与分析

2.1不同氮肥施用对土壤性质的影响

不同氮肥施用对土壤化学性质的影响见表1。根际土壤样本中，施氮肥处理较NO处理pH值降低了0.12-0.31个单位，其中SCU处理pH值最低，为5.37。施氮肥可提高土壤碱解氮含量，其中以SU处理最为显著，为80.29 mg·kg-1。不同氮肥施用对土壤有机质、速效钾及速效磷的影响不显著（Pgt;0.05）。

2.2固氮微生物nifH基因丰度及土壤性状对其的影响

由图1a可知固氮微生物nifH基因的丰度为3.4x10-4.9x10 copies·g-1，除SF处理显著降低外，其余施氮肥处理固氮微生物nifH基因丰度与NO处理无显著差异。不同施氮肥处理中，SF处理的固氮微生物nifH基因丰度（3.4x10 copies·g-1）低于其他处理。土壤性质对基因丰度的相对影响由ABT模型确定（图1b），其中pH和有机质是影响固氮微生物nifH基因丰度的主要因素，相对影响值分别为44.51％和35.01％。

2.3不同新型氮肥对nifH基因Alpha多样性的影响

本文中的Alpha多样性指数通过Chaol和Shannon指数进行分析，Chaol指数用来评估样品中所含OTU的总数，其值越大nifH基因丰富度越高。与NO处理相比，氮肥施用降低了nifH基因丰富度，其中SF处理降低比例最大，降低了16.6％；不同氮肥施用处理中，新型氮肥处理的固氮微生物nifH基因丰富度高于CU处理。

Shannon指数用来估算固氮微生物nifH基因多样性，其值越大，多样性越高。通过分析发现，NO处理的固氮微生物nifH基因多样性高于施氮处理；不同氮肥施用处理中，SF和SCU处理的nifH基因多样性指数低于CU处理，但均未造成显著差异。

2.4不同新型氮肥对固氮微生物群落Bate多样性的影响

图3为固氮微生物的NMDS分析，应力函数值（Stress=0.132）小于0.2，说明NMDS分析排序性良好，可准确反映样本点的真实分布情况。NO处理与CU、SU、SF、SCU处理明显分离，不同氮肥施用处理的空间分布较集中。ANOSIM分析发现，施氮肥处理与NO处理间存在显著差异（P=0.001），但施用不同新型氮肥处理与CU处理间不存在显著差异（P=0.1）。

由表2可知，施氮显著影响（P=0.002）固氮微生物群落结构，氮肥类型显著影响（P=0.006）nifH基因多样性。

2.5不同新型氮肥对土壤固氮微生物群落组成的影响

由图4可知固氮微生物nifH基因属水平注释结果中共有10个菌属，其中Desulfovibrio（脱硫弧菌，丰度为14.11％-33.40％）、Stenotrophomonas（寡养单胞菌，丰度为2.66％-17.72％）和Bradyrhizobium（慢生根瘤菌，丰度为2.68％-6.32％）为主要优势菌属。除Others外，Desulfovibrio在NO和SU处理中注释结果丰度最高，占比分别为27.34％和33.40％；而CU和SF处理中固氮微生物nifH基因注释结果丰度最高的属为Stenotrophomonas，占比分别为14.92％和17.72％。与NO相比，SU、SF、SCU处理Stenotrophomonas的相对丰度分别显著提高了44.00％、48.65％和100.00％，SU、SCU处理Bradyrhizobium的相对丰度分别降低了31.29％和34.30％，而SF处理使Bradyrhizobium的相对丰度提高了42.92％。与CU处理相比，SU、SF、SCU处理Stenotrophomonas的相对丰度分别降低了47.51％、15.81％、22.80％，Bradyrhizobium的相对丰度分别提高了13.66％、136.66％、8.53％。

3讨论

土壤固氮菌群落对氮肥添加的响应对土壤氮供应的可持续性非常重要，关于固氮微生物的研究已经有很多，其中有研究表明不同肥料可使固氮微生物多样性及结构发生改变。本研究中（图1a），施氮处理的固氮微生物nifH基因拷贝数低于不施氮肥处理，这与李颖在玉米／大豆间作体系试验中得到的随着施氮量的增加固氮微生物nifH基因拷贝数逐渐下降的研究结果一致，且本研究结果并未表现出显著差异，也与多数研究中氮肥的添加对固氮微生物nifH基因拷贝数的变化无显著影响的结果一致。ABT分析结果（图1b）表明，土壤pH是驱动土壤固氮菌生长的主要因素，作为外源养分，氮肥在调节土壤pH方面发挥了重要作用，氮肥对土壤pH的调节间接影响了固氮微生物nifH基因丰度。本研究中，与不施氮相比，氮肥施用降低了固氮微生物nifH基因的Alpha多样性指数，这与一项对东北黑土区玉米根际微生物群落的研究结果一致，微生物群落对氮的输入具有抗性，随着氮输入的增加，Alpha多样性显著降低。新型氮肥相比常规尿素施用增加了固氮微生物nifH基因丰富度但降低了多样性，可能原因是新型氮肥能够延缓氮素释放，使整个生育期内的固氮微生物大量富集。

对固氮微生物nifH基因属水平注释结果分析发现，Stenotrophomonas和Bradyrhizobium为主要的优势菌属，刘爽等的研究也证明在固氮微生物nifH相关分析中，Stenotrophomonas和Bradyrhizobium属的相对丰度较高。本研究发现与不施氮肥和施用常规尿素相比，施用新型氮肥处理显著提高了Stenotrophomonas菌属的相对丰度，包海花的研究发现Stenotroph-omonas菌属与农田氮转化相关，是一种能降解硝酸盐、降低总氮含量的菌，正由于这种特性，导致它在施用新型氮肥处理中具有较高的含量，同时王保莉等研究发现，在以硝酸钠为氮肥的处理中Stenotrophomonas为优势菌属，说明施用不同类型的氮肥会造成Stenotrophomonas菌属相对丰度的改变。而所有处理中，只有SF处理提高了Bradyrhizobium的相对丰度，其余处理均为降低趋势，Bradyrhizobium为慢生型根瘤菌，施用不同类型的氮肥会导致Bradyrhizobium相对丰度的变化，而Mark等发现Bradyrhizobium可以促进作物对氮的吸收，增加作物产量，这与本研究在分析作物产量部分的研究结果一致，即施稳定性肥料处理的作物产量最高。

施氮与不施氮处理在NMDS分析中明显分离，但3种新型氮肥与常规尿素相比，固氮微生物群落结构无明显区别，ANOSIM结果与其相同。为了进一步验证施用氮肥和氮肥类型对固氮微生物nifH基因多样性及结构的影响，本研究进行了PERMANOVA分析，结果与ANOSIM分析一致，氮肥类型对固氮微生物nifH基因多样性的影响更大，而群落结构主要受施氮影响。这与Chen等在东北黑土上一项长期定位试验结果一致，即不同含量氮肥的施用显著影响固氮菌的群落结构。不同类型新型氮肥对固氮微生物nifH基因结构无显著影响，可能原因是玉米连年种植均施用氮肥，在长期定位的8年间，根际效应形成了稳定的微生物群落，因此新型氮肥类型不会造成当季的显著差异。

4结论

长期定位田间试验结果显示，新型氮肥通过影响土壤pH及有机质影响固氮微生物nifH基因拷贝数。与常规尿素处理相比，新型氮肥的施用降低了固氮微生物nifH基因拷贝数，其中以施稳定性肥料处理降低效果最为显著；新型氮肥施用显著影响固氮微生物nifH基因的Alpha多样性指数，但对固氮微生物nifH基因群落结构的影响并不显著。