剩余污泥腐植酸的提取和对作物幼苗建成的影响

摘要：为解决IHSS（国际腐植酸协会）推荐法提取剩余污泥腐植酸参数不明确和剩余污泥腐植酸提取研究中缺乏其毒性效应评价等问题，利用响应曲面法得到剩余污泥腐植酸提取的最佳条件，并分析了腐植酸理化特性及其对作物幼苗建成的影响。结果表明，腐植酸提取的最佳条件：碱浓度为0.19 mol·L-1，碱泥比（mL；g）为11.6，振荡时间为3.8h，提取量为96.1 mg·g-1。相较于推荐法的腐植酸提取量增加了118％。提取所得腐植酸的元素分析显示，0/C为0.84，H/C为0.14，C/N为4.43；傅里叶变换红外光谱和凝胶渗透色谱分析显示，剩余污泥腐植酸存在羧基、醇羟基和酚羟基等含氧官能团，重均分子量为8 856 Da。此外，在500 mg·L-1施用条件下，该腐植酸对大白菜和萝卜种子发芽率和子叶光合色素含量均无显著影响，而对大白菜种子胚根伸长具有显著促进作用。综上，通过优化提取条件可显著提高腐植酸提取量，剩余污泥腐植酸腐殖化程度与芳香化程度均较高，分子量较小，生物活性较强，且低浓度下对作物早期生长无不良影响。

关键词：剩余褥泥腐植酸；提取条件；幼苗建成；种子发芽；子叶光合色素

中图分类号：X703；S634.1；S631.1 文献标志码：A 文章编号：1672-2043（2024）02-0426-08 doi：10.11654/jaes.2023-0855

随着我国城镇化的快速发展，生活污水处理规模不断扩大，导致大量剩余污泥产生。据统计，截止到2020年，我国每年产生的剩余污泥量已超过6 000万m3。2021年6月国家发展改革委与其他部门联合编制了《“十四五”城镇污水及资源化利用发展规划》，该规划提出到2025年，城镇污泥资源化利用水平进一步提升，要求在实现稳定化和无害化的前提下，稳步推进污泥资源化利用。

剩余污泥富集了大量有机物，以腐植酸为例，其含量一般占污泥有机物含量的10％-20％，具有良好的资源属性。腐植酸含有羧基、酚羟基、羰基和甲氧基等含氧官能团，生物活性较强，具有促进植物根系生长以及促进植物吸收养分等作用，在农业领域应用颇广。目前，国内外对剩余污泥腐植酸的提取多采用国际腐植酸协会（IHSS）推荐法，但此法仅适用于土壤腐植酸的提取。由于不同来源腐植酸的结构、组成以及元素含量不同，因此，亟待对其提取条件进行优化。

由于污泥成分复杂，含有重金属等有害物质，所以也具有一定的“污染”属性。但已有的剩余污泥提取腐植酸研究中缺乏对其毒性效应的综合评价。幼苗建成（seedling establishment）是指从种子发芽开始，幼苗依赖种子贮藏物质进行异养生长，当其子叶获得光合能力，进行自养生长时完成的早期生长阶段。通常，利用种子发芽试验可快速评价某一物质的植物毒性，但只反映了其对植物地下部生长的影响。然而，在种子发芽的基础上，通过观察和分析幼苗建成后期子叶的转绿情况，可较为全面地评价某一物质对植物地上部生长的影响，即通过幼苗建成试验可较为全面地评价物质的毒性效应。目前，幼苗建成试验在评价抗生素植物毒性、稀土元素对植物早期生长的影响和畜禽粪便堆肥产品腐熟度方面得到应用。因此，利用幼苗建成试验可较为快速且全面地评价剩余污泥腐植酸对植物早期生长的影响，为其安全利用提供数据支撑。

本研究综合考虑提取条件中各因素对腐植酸提取量的影响，参考IHSS推荐法并利用Box-Behnken法设计试验，确定剩余污泥腐植酸的最佳提取条件。此外，对提取所得腐植酸进行了理化特性研究，利用植物毒性测试中常用作物大白菜和萝卜的幼苗建成试验，以种子相对发芽率、胚根相对长度和子叶相对光合色素含量为评价指标，对其生物效应进行了快速且全面的评价。本研究可为剩余污泥腐植酸的提取和应用提供参考。

1材料与方法

1.1剩余污泥来源与性质

本研究使用的剩余污泥样品采集于山西省太原市某污水处理厂，于4℃条件下保存待用。剩余污泥含水率为80.5％±0.2％，pH为7.7±0.1，总固体（TS）为（195±2）mg·L-1，可溶性化学需氧量（SCOD）为（4 689±13）mg·L-1，总化学需氧量（TCOD）为（67 678±1 142）mg·L-1，挥发性固体（VS）为50.9％±0.3％，总腐植酸含量为17.0％±0.7％。

1.2试验方法

1.2.1响应曲面试验设计

剩余污泥经表面活性剂联合超声波预处理后进行腐植酸提取试验。参考IHSS推荐法，将预处理后的剩余污泥中加入0.1 mol·L-1 HCl溶液并振荡反应1 h，离心去除上清液，得到沉淀。然后加入NaOH溶液振荡离心后去除沉淀，得到上清液并测定腐植酸含量。再根据Box-Behnken设计原理以及参照提取试验结果确定的条件范围，选择碱浓度（X1）、碱泥比（X2）与振荡时间（X3）为剩余污泥腐植酸提取量的3个显著影响因子，以腐植酸提取量为响应值，采用三因子三水平的响应曲面法进行优化试验。通过分析多变量二元回归方程确定腐植酸提取优化的最佳参数。试验参数设计见表1。

1.2.2利用作物早期生长试验对剩余污泥腐植酸植物毒性进行评价

根据前期预试验结果，试验共设置500 mg·L-1和1 000 mg·L-1腐植酸溶液处理，去离子水为对照（未添加腐植酸），每个处理均设3个重复。分别取大白菜种子30颗和萝卜种子20颗，置于垫有一张定性滤纸的方形培养皿（10 cmx10 cm）中，加入去离子水或腐植酸溶液4 mL后置于培养箱中，于25℃条件下黑暗培养24 h，培养后计算种子相对发芽率。然后每个培养皿保留一半数量大小相近的种子，分别补加2 mL去离子水或腐植酸溶液后继续于25℃条件下黑暗培养24 h，培养后计算种子胚根相对根长。黑暗培养完成后补加2 mL去离子水或腐植酸溶液，设置光照强度为6 000 1x，光照培养12 h，培养后测定子叶相对光合色素含量。

1.3分析方法

含水率、挥发性固体VS、总固体TS采用重量法测定，可溶性化学需氧量SCOD和总化学需氧量TCOD采用快速消解分光光度法（HJ/T 399-2007）测定，pH利用pH仪测定（CJ/T 221-2005），总腐植酸含量采用GB/T 11957-2001测定。

称取约1 mg干燥的腐植酸置于元素分析仪（Unicube，德国Elementar公司）中测定分析C、H、O、N元素的含量，并根据含量分析O/C、H/C和C/N原子比；傅里叶变换红外光谱测定由傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet lS5，美国Thermo公司）测定，测定之前去除样品水分，取2 mg干燥样品与200 mg KBr混合，压成薄片后进行分析，扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为1 cm-1；凝胶渗透色谱由凝胶渗透色谱仪（1525，美国Waters公司）测定，分析条件为色谱柱BioSep-SEC-S2000（5 um硅胶载体，300 mmx7.8 mm）及同系列的保护柱（30 mmx7.8 mm），色谱柱温度为40℃，流动相为四氢呋喃，流速为1.0 mL·min-1。

1.4数据处理与分析

利用Excel软件对数据进行处理，结果以平均值±标准差的形式表示。采用SPSS 19.0软件对试验数据进行单因素方差分析，利用LSD法比较结果之间的差异，显著性设为Plt;0.05。采用Origin 2021软件制图。

2结果与讨论

2.1剩余污泥腐植酸提取响应优化结果

2.1.1剩余污泥腐植酸提取响应曲面试验的设计与结果

表2为响应曲面试验的设计与结果，对表中的数据进行多元二次回归方程的拟合，得到回归模型的方程为Y=94.8-5.1X1-4.5 X2-6.7 X3+2.5 X1X2-2.1X1X3+1.3X2X3-21.4X12-13.8X22-18.9X32。回归模型的R2=0.982 9，说明该回归模型相关性良好。Adj R2=0.961 0，Pred R2=0.795 9，二者之差小于0.2，因此，该回归模型的准确度和精确度较高。

响应曲面试验的方差分析见表3。回归模型的F值为44.76，P值lt;0.000 1，说明模型拟合良好。而方差分析结果中，P值和F值反映了各因子对响应值的影响程度，F值越大，P值越小，各因子对响应值的影响越显著。因此各因子均与腐植酸提取量之间存在极显著的线性关系，提取条件的影响程度为振荡时间（P=0.001 4）gt;碱浓度（P=0.005 9》碱泥比（P=0.011 2）。

2.1.2响应曲面试验最佳条件

利用回归模型得到的剩余污泥腐植酸提取最优条件：碱浓度为0.19 mol·L-1、碱泥比（mL：g）为11.6、振荡时间为3.8 h，预测得到的最大腐植酸提取量为96.1 mg·g-1。进行验证试验后发现回归模型的预测值偏差小于5％，说明回归模型拟合度较好。根据表2可知，当振荡时间一定时，腐植酸提取量随着碱浓度和碱泥比的提升出现先增加后减小的趋势。当碱泥比一定时，腐植酸提取量也出现先增加后减小的趋势。当碱浓度一定时，在一定范围内，振荡时间和碱泥比不断增加，腐植酸提取量也出现先增加后减小的趋势。这可能是由于随着时间的延长，腐植酸不断地溶解至溶液中，当达到溶解饱和时，会被重新吸附至剩余污泥表面。也有研究者认为，随着碱泥比和碱浓度的提升，溶解至液相中的腐植酸进一步分解为小分子的水溶性提取物和二氧化碳。

2.2剩余污泥腐植酸表征

2.2.1元素分析

为了分析腐植酸元素组成与结构，对其进行了元素分析，结果见表4。剩余污泥腐植酸主要由C、H、O和N元素组成，其中C含量为37.74％，H含量为5.26％，O含量为31.80％，N含量为8.51％，C含量最多，H含量最少。本研究所得剩余污泥腐植酸与表4中其他研究所得腐植酸的元素含量相差较小。腐檀酸样品的O/C原子比可鉴别羧基等含氧官能团的含量。本研究腐植酸的O/C为0.84，高于张静静、李有康等和刘超超等研究中剩余污泥腐植酸的O／C，与其他剩余污泥腐檀酸的O/C类似，说明本研究腐植酸存在较多的含氧官能团。H/C原子比是比较样品腐殖质芳香度的有效定性参数。本研究腐植酸的H/C为0.14，接近其他剩余污泥腐植酸的H/C，由此可见，本研究腐植酸可能含有较多数量的芳香基团，芳香化程度较高。C/N可揭示腐植酸的腐殖化程度。本研究剩余污泥腐植酸的C/N最低，为4.43，证明其腐殖化程度较高，形成络合物的稳定性也较高。这可能是由于有机物在本研究剩余污泥的来源中占比较高，并且二级处理工艺中的微生物活性高，分解了剩余污泥中的有机质，释放出大量的小分子有机化合物，包括了腐植酸前体物质，从而促进了剩余污泥腐植酸的腐殖化。

2.2.2红外谱图分析

腐植酸作用效果受其官能团种类的影响，其可促进植物生长过程中对养分的吸收，也可调控作物生长环境。为了确定剩余污泥腐檀酸的结构和官能团信息，本研究进行了傅里叶变换红外光谱分析。剩余污泥腐植酸的傅里叶变换红外光谱见图1。如图所不，在4 000-400 cm-1波数范围内，出现了8个腐植酸特征吸收峰。在3 371 cm-1波数附近的峰代表酚羟基和醇羟基-OH的振动；2 927 cm-1波数附近的峰归因于脂肪烷烃结构中-CH的伸缩振动；2 361 cm-1波数出现较小的峰，这是羧基的-OH和-H伸缩振动导致的；1 657 cm-1波数出现的峰也是羧基的特征峰，这是羧基中的C=O伸缩振动引起的；1 541cm-1波数附近的峰通常被认为是芳香共轭双键引起的；1 232 cm-1波数附近的峰则归因于酚、醚或醇的C-O伸缩和-OH的变形振动；1 057 cm-1和564 cm-1波数附近的峰归因于脂肪醇、醚、硫醇基的伸缩振动以及磺基、硫醇基等含硫化合物的伸缩振动。以上结果说明，剩余污泥腐植酸存在较多含氧官能团，生物活性较高。

2.2.3凝胶渗透色谱分析

腐植酸相对分子质量越小，其生物活性越强。为了确定剩余污泥腐植酸的相对分子质量，判断其生物活性，本研究利用凝胶渗透色谱法对其进行了分析，剩余污泥腐植酸的相对分子质量分布如图2所示。由图2可知，剩余污泥腐植酸的1g Mw主要分布在3.0-4.5之间，与之对应的相对分子质量分布在1-32 kDa之间。剩余污泥腐植酸的Mw（重均分子量）为9 kDa，Mn（数均分子量）为4 kDa，相较于张静静研究中剩余污泥腐植酸的相对分子质量（Mw=27 kDa，Mn=25 kDa）和李有康等研究中剩余污泥腐植酸的相对分子质量（30-50 kDa）以及堆肥腐植酸的相对分子质量（Mw=14-17 kDa）和森林土壤腐植酸的相对分子质量（Mw=42 kDa），本研究中腐植酸的相对分子质量较小，具有较强的生物活性。

2.3剩余污泥腐植酸的植物毒性评价

2.3.1种子发芽

不同浓度腐植酸溶液对大白菜、萝卜种子发芽率的影响如表5所示。由表5可知，不同浓度下大白菜种子发芽率分别为96.7％、90.0％和84.4％。与0 mg·L-1相比，500 mg·L-1腐植酸处理的大白菜种子发芽情况并无显著性差异（Pgt;0.05），而1 000 mg·L-l腐植酸处理的大白菜种子的发芽情况却存在显著性差异（Plt;0.05）。这可能是因为水分是种子发芽的先决条件，当腐植酸溶液浓度较低时，在种子本身的抗逆性作用下，抑制水分吸收的效果不明显，而当腐植酸溶液浓度提高后，其电导率也随之上升，盐浓度的增加抑制了种子对水分的吸收。在此情况下，种子本身的代谢反应难以抵抗高浓度溶液的影响，导致发芽率降低。而三个处理的萝卜种子发芽情况均无显著性差异（Pgt;0.05），发芽率分别为90.0％、90.0％和80.0％。这可能是由于萝卜的种皮较厚，可阻碍高浓度腐植酸溶液对其产生的负面影响，亦或者是萝卜种子本身的抗逆性较强，可削弱高浓度腐植酸溶液对其产生的影响。

2.3.2种子胚根伸长

观察不同浓度腐植酸溶液条件下作物种子根长的发育情况，可进一步评估其植物毒性，图3为不同浓度腐植酸溶液对大白菜、萝卜种子根长的影响，由图3（a）可知，500 mg·L-1与1 000 mg·L-1腐植酸溶液对大白菜的根长发育有良好的促进作用，相对根长分别为126.1％和140.6％。这是因为适量的腐植酸能够提高植物ATP酶的活性，从而刺激种子胚根伸长。此外，凝胶渗透色谱分析显示，本研究腐植酸分子量较小，而小分子量腐植酸对促进作物根系生长有重要作用，故对大白菜种子胚根伸长具有一定促进作用。而从图3（b）可知，当腐植酸溶液浓度大于1 000mg·L-1时，其对萝卜的根长生长具有抑制作用（Plt;0.05），相对根长从100.7％降低至79.2％。这可能是由于萝卜种子颗粒较大并且腐植酸溶液浓度过大时，培养皿中的水分不足以供给萝卜种子的需求，而小颗粒的大白菜种子在培养皿中能够进一步生长。

2.3.3作物子叶光合色素

光合色素是作物进行光合作用的物质基础。通过测定作物子叶光合色素的含量可评估腐植酸溶液对作物的胁迫作用。图4（a）与图4（b）分别为不同浓度腐植酸溶液对大白菜、萝卜子叶光合色素含量的影响。由图4可知，与O相比，500 mg·L-1和1 000 mg·L-1腐植酸溶液对大白菜光合色素含量的影响无著性差异，相对叶绿素a含量分别为104.2％和101.9％，相对叶绿素b含量分别为96.0％和102.7％，相对类胡萝卜素含量为99.0％和101.4％。萝卜子叶也有相同的影响，相对叶绿素a含量分别为103.3％和104.5％，相对叶绿素b含量分别为93.0％和108.0％，相对类胡萝卜素含量为104.9％和101.6％。叶绿体是植物幼苗进行光合作用的场所。作为重要的细胞器之一，虽然它被细胞壁与细胞膜层层保护，但是在重金属和盐分等非生物胁迫下，叶绿体结构会遭到破坏，影响光合色素的合成。而刘彩娟等发现干旱胁迫下，黄腐酸可维持叶绿体的超微结构，增加叶绿素含量。本研究中不同浓度腐植酸对大白菜和萝卜子叶光合色素含量均无显著影响，这可能是由于腐植酸中的营养元素会促进子叶生长，可抵消高浓度腐植酸对其产生的不利影响。

3结论

（1）通过响应曲面法优化了腐植酸的提取条件，提取量相较于国际腐植酸协会推荐法增加了118％；在种子发芽试验的基础上，通过幼苗建成试验全面评价了腐植酸对植物早期生长的影响。

（2）腐植酸提取的最佳条件为碱浓度0.19 mol·L-1、碱泥比（mL：g）11.6、振荡时间3.8 h。预测得到的最大腐植酸提取量为96.1 mg·g-1。3个因子对腐植酸提取量的影响程度为振荡时间gt;碱浓度gt;碱泥比。

（3）剩余污泥腐植酸的O/C为0.84，H/C为0.14，C/N为4.43，芳香化程度与腐殖化程度较高，含有丰富的含氧官能团，且相对分子质量较小，具有较高的生物活性。

（4）剩余污泥腐植酸在低浓度时会促进大白菜种子胚根伸长，而在高浓度时对大白菜种子发芽以及萝卜种子胚根伸长有一定抑制作用。腐植酸对大白菜和萝卜子叶光合色素含量均无显著影响。