芽孢杆菌及其胞外多糖对空心菜和茼蒿Cd吸收及土壤团聚体的影响

摘要：本研究旨在探究产胞外多糖芽孢杆菌对蔬菜镉（Cd）积累及土壤结构的影响。采用以空心菜和茼蒿为供试材料的盆栽试验，研究了功能菌株Priestia megatermm YG35和Bacillus halodurans G20降低蔬菜吸收Cd的效果和可能作用机制。结果表明，与CK相比，菌株YG35、菌株G20及其胞外多糖处理显著增加空心菜和茼蒿可食用组织干质量（37.8％-115.1％），显著降低可食用组织Cd含量（21.9％-44.2％），并使茼蒿Cd含量（0.057-0.061 mg·kg-1）达到安全可食用标准，显著降低根际土壤有效态Cd含量（3.7％-11.7％），显著（Plt;0.05）增加根际土壤多糖含量（35.9％-49.5％）和蔗糖酶活性（15.3％-28.4％），促进根际土壤团聚体向大粒径转化。研究表明，YG35和G20及其胞外多糖能降低蔬菜对Cd的吸收，促进蔬菜生长，改善土壤结构，具有在Cd污染土壤上实现蔬菜安全生产的应用潜力。

关键词：胞外多糖；芽孢杆菌；空心菜；茼蒿；Cd；土壤

中图分类号：X53；S636.9 文献标志码：A 文章编号：1672-2043（2024）01-0060-08 doi：10.11654/jaes.2023-0560

镉（Cd）作为一种非氧化还原性重金属，在土壤中积累不仅影响农用地的理化性质和质量，而且对植物有较强的毒害作用。Cd积累会降低土壤养分，不仅影响作物的正常生长，而且会影响土壤动物的健康和数量，改变土壤微生物的结构和多样性，影响Cd在土壤中的固定。重金属被植物吸收后，会引起植物组织的氧化应激反应，影响植物生长和植物对铁（Fe）、锰（Mn）和镁（Mg）等必需营养元素的吸收。土壤重金属超标导致蔬菜作物可食用组织重金属含量超标，并通过食物链进入人体威胁人体健康。人体摄入Cd后，会打破细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡，从而诱发恶性肿瘤的形成川，因此，修复Cd污染土壤、减少蔬菜作物可食部分Cd的积累迫在眉睫。

植物促生菌可以改善植物在重金属污染土壤上的生长状态，并且通过吸附固定重金属和改变重金属氧化态等不同的抵抗策略来帮助植物承受环境胁迫。一些重金属固定微生物能够通过自身吸附和分泌代谢产物等方式直接或间接地降低土壤中的Cd、Pb离子浓度，将假单胞菌、沙雷氏菌和苏云金芽孢杆菌接种到植物根际能够显著缓解Cd、Pb对植物的胁迫，其次植物促生菌还可以改善土壤微环境，调节根际环境通气性，从而促进植物根部发育，更有益于吸收营养。

微生物自身会产生并释放大量的天然胞外聚合物，作为阻挡重金属的第一道防线，不仅可以通过吸附、络合和沉淀作用固定重金属，还能提高微生物的金属耐受性及改善土壤环境。现已经发现胞外聚合物作为高度复杂的混合物，能够在细胞间相互作用中起重要作用，其中主要以胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）为主，多糖成分可以为生物膜中的细胞提供诸多益处，其胞外分泌的聚合多糖类物质能作为一种分子胶水，增强细胞间的相互黏附作用、促进生物和非生物表面的定殖过程，以及促进微菌落和生物膜的产生，具有保水性、从环境中收集养分和提高细菌生物膜对环境抵抗力的功能。有研究者将产多糖菌株施入重金属污染土壤，也有许多研究者将胞外聚合物直接应用于土壤，发现能够降低植物重金属含量，促进种子发芽率和提升土壤保水能力。EPS可根据组成成分不同分为杂多糖和同多糖，大部分微生物产生EPS都是杂多糖，不同的微生物产生的EPS又具有不同的单糖组分，因此钝化重金属的能力也差异很大，而目前探究不同产EPS细菌及其不同类型EPS降低蔬菜中重金属和改善土壤理化性质的研究较少，且前人的研究对象较为单一。

因此，本研究以江苏省南京市栖霞山矿区附近重金属污染农田土壤为供试土壤，采用盆栽试验，探讨两种产胞外多糖菌株及其EPS对空心菜和茼蒿生长、Cd吸收、土壤有效态Cd含量和土壤理化性质的影响，以期为蔬菜安全生产及改善Cd污染农田土壤提供新型材料和理论依据。

1材料与方法

1.1供试材料

供试菌株为实验室保藏菌株Pn：estia megaterium YG35和Bacillus halodurans G20，且两株菌所产EPS均为杂多糖。菌株YG35分离自山东滨州盐碱土（32°22′N，118°02′E），吲哚乙酸（Indoleacetic acid. IAA）产量（7.63+0.53） mg·L-1和EPS产量1.165 g·L-1；菌株G20分离自内蒙古砒砂岩区土壤（39°26′56″N，110°43′32″E），IAA产量（8.31+0.11）mg·L-1和EPS产量1.191 g·L-1。LB培养基：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，溶于蒸馏水，pH 7.2。产糖培养基：蔗糖20 g，NaCl 10 g，酵母膏5g，去离子水1L。供试土壤采自江苏省南京市栖霞区重金属污染农田土壤（32°7′N，118°57′E）。总Cd含量（2.03+0.1）mg·kg-1。供试蔬菜为空心菜（Ipomoea aquatica Forsk）和小叶茼蒿（Chrysanthemum coronarium L.var.spatiosum Bailey），种子购买于江苏省农科院种子站。

1.2菌液和EPS制备

将供试菌株接种到新鲜的100 mL LB液体培养基，30℃，180 r·min-1振荡培养至对数生长中期，取菌液5 000 r·min-1离心10 min收集菌体并清洗，弃上清液后用无菌去离子水重悬，制成OD600为1.0的菌悬液。将部分菌悬液在121℃进行灭菌30 min作为灭菌悬液。

EPS制备参考Du等的方法。将活化后的菌株按2％接种量接种到300 mL产糖培养基中，30℃培养72 h，取菌液5 000 r·min-1离心10 min，取上清液置于锥形瓶中，加入4倍预冷的无水乙醇，颠倒混匀后置于4℃醇沉24 h，10 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，向沉淀中加入预冷的无水乙醇并重复以上操作一次，得到的沉淀物用10 mL去离子水重悬，加入Sevage溶液（三氯甲烷：正丁醇=4：1），剧烈振荡后离心，保留上层水相，多次重复直至中间层无白色蛋白杂质沉淀，取上层水相重沉淀后烘干保存。用去离子水复溶多糖，以苯酚-硫酸法测定胞外多糖浓度，制成浓度为3.78 mg·mL-1的EPS溶液。

1.3盆栽试验设计

试验共分为7个处理：无处理对照组（CK）、YG35菌液处理组（YG35）、G20菌液处理组（G20）、YG35 EPS处理组（YG35 EPS）、G20 EPS处理组（G20 EPS）、YG35灭菌液处理组（YG35 S）、G20灭菌液处理组（G20 S），每个处理3个平行。直接风干后过2 mm筛的土壤装入塑料盆钵中，每盆装土1 kg，种植前先浇水孵育3d。将两种蔬菜种子分别用75％的乙醇消毒5 min，无菌去离子水冲洗3次后浸泡于菌悬液和EPS溶液中2h，对照组用无菌去离子水浸种。将对应浸种后的蔬菜种子均匀播撒在湿润土壤表面后，撒干燥的薄土覆盖，不透光薄布遮盖，待发芽后掀开薄布，待植物长出两片真叶后间苗，10 d和20 d后补接菌液（5％接菌量）及EPS溶液（15 mL），最后每盆留下茼蒿15株，空心菜5株。在蔬菜整个生长过程（45 d）中定期浇水保持土壤环境湿度适宜。

1.4样品采集

土壤试验：将土壤取出置于阴凉处风干，研磨过2 mm筛，进行有效态Cd含量的分析。

盆栽试验：将蔬菜从盆钵中取出，轻轻抖动蔬菜掉落的土壤作为非根际土壤，再次抖动和轻取根系黏附的土壤作为根际土壤，风干后室温保存，一部分过2 mm筛。蔬菜收获时分为根和地上部两部分，用去离子水洗净。

1.5测定方法

1.5.1蔬菜生物量和Cd含量的测定

用纱布擦干蔬菜表面多余水分后，测定可食用组织鲜质量；根部用0.01 mol·L-1 EDTA-2Na溶液浸泡10 min，然后用去离子水冲洗干净，最后再放置于80℃烘箱中烘干至质量恒定，测定可食用组织和根部干质量。分别磨碎干燥后的蔬菜可食用组织和根部样品，称取0.10 g于微波消解仪中用浓HNO3（2 mL或5 mL）进行消解，消解液用去离子水定容至25 mL，取4 mL用0.45 um水系过滤器过滤，ICP-OES测定消解液中Cd含量。

Cd转移系数（Translocation Factor，TF）=蔬菜可食用组织Cd含量（mg·kg-1）/蔬菜根部Cd含量（mg·kg-1）。

1.5.2土壤有效态Cd含量的测定

称取风干研磨过2 mm孔径筛的土壤1.0 g，将其与DTPA提取剂按1：4（m：V）混合，置于摇床上180 r·min-1室温振荡2h，8 000 r·min-1离心5 min，取2 mL上清液用0.45 um水系过滤器过滤，与5％ HNO3等体积混合后用ICP-OES测定上清液中Cd浓度。

1.5.3土壤多糖含量及蔗糖酶活性测定

土壤多糖的测定参考张弢的方法并做适当修改，取1.0 g已经风干研磨过2 mm筛的土壤到10 mL离心管，加入5 mL 4 mol·L-1的H2SO4沸水浴提取6h，期间每隔th振荡混匀一次，6 000 r·min-1离心5 min，取上清液调pH为7.0，定容至10 mL，用蒽酮-硫酸法测定溶液中多糖含量。土壤蔗糖酶活性的测定参考关松荫的方法。

1.5.4土壤团聚体的测定

土壤团聚体的测定参考刘武江等的方法并做适当修改，取盆栽试验中蔬菜新鲜根际土壤，平铺放置在阴凉通风处自然晾干，称取35 g不经研磨的风干土，置于套筛（孔径大小依次为2、1、0.5 mm和0.25mm）收集不同粒径的土壤团聚体，以每分钟30次的频率水平振荡2-3 min，将各筛上的干土样品称量后装袋保存，即得gt;2、2-1、lt;1-0.5、lt;0.5-0.25、lt;0.25 mm五种不同粒径的土壤团聚体。

1.6数据处理与分析

试验数据利用Excel 2016软件和Graphpad Prism 8.0.2制表和作图。采用SPSS 22.0对数据进行统计分析，采用ANOVA单因素方差分析差异显著性。

2结果与分析

2.1供试菌株及其多糖对茎菜生物量和Cd含量的影响

在盆栽试验中，与CK相比，菌株YG35、G20、YG35 EPS和G20 EPS处理均能显著增加空心菜和茼蒿地上部可食用组织生物量（图1），四个处理能够使空心菜可食用组织干质量显著增加44.9％-54.0％，茼蒿可食用组织干质量显著增加37.8％-115.1％（Plt;0.05），其中菌株YG35能使茼蒿可食用组织干质量显著增加达115.1％，促生效果最好。与CK相比，灭菌液处理组对两种茎菜可食用组织干质量没有显著影响。

如图2所示，与CK相比，YG35、G20、YG35 EPS和G20 EPS处理组均能显著降低空心菜和茼蒿可食用组织和根部Cd含量（Plt;0.05）。四个处理组能够使空心菜可食用组织Cd含量分别显著降低21.9％-36.8％，根部Cd含量分别显著降低7.5％-10.3％；四个处理组能够使茼蒿可食用组织Cd含量下降更低（34.7％-44.2％），Cd含量（0.057-0.061 mg·kg-1）低于茎类新鲜蔬菜Cd限量值0.1 mg·kg-1，达到安全可食用标准，根部Cd含量分别显著降低20.5％-38.3％。菌株YG35减少空心菜和茼蒿Cd含量的效果优于菌株G20。灭菌液处理组的两种蔬菜Cd含量与CK相比没有显著差异。菌液及EPS处理减少茼蒿吸收Cd的效果更优于空心菜，可能是不同类型蔬菜对金属转运的能力不同。

2.2供试菌株及其多糖对土壤有效态Cd含量的影响

如图3所示，与CK相比，YG35、G20、YG35 EPS和G20 EPS处理组都能显著降低蔬菜根际土壤有效态Cd含量，其中空心菜根际土有效态Cd含量显著下降3.7％-7.4％，茼蒿根际土有效态Cd含量下降10.0％-11.7％，EPS处理与活菌处理组降低根际土壤有效态Cd含量的效果相当。

2.3供试菌株及其多糖对土壤理化性质的影响

与CK相比，YG35、G20、YG35 EPS和G20 EPS处理组能够使空心菜根际土壤多糖含量显著增加37.1％-46.9％，使茼蒿根际土壤多糖含量显著增加35.9％-49.5％（图4A），EPS处理与活菌处理组效果相当。四个处理组能够使空心菜根际土壤蔗糖酶活性显著增加15.3％-18.9％，使茼蒿根际土壤蔗糖酶活性显著增加19.5％-28.4％（图4B）。与CK相比，灭活菌液处理组对两种蔬菜根际土壤多糖含量没有显著影响。

通过测定分析空心菜和茼蒿根际土壤团聚体颗粒的粒径，发现不同处理对团聚体影响不同，结果如表1所示，与CK相比，接菌YG35和G20分别使空心菜根际土壤gt;2 mm团聚体显著增加30.8％和24.2％，显著减少1-0.5 mm团聚体（21.6％和16.6％）、lt;0.5-0.25 mm团聚体（27.1％和25.1％）和lt;0.25 mm团聚体（27.3％和22.4％），YG35 EPS和G20 EPS处理组与活菌处理影响相似，能够使空心菜根际土壤gt;2 mm团聚体显著增加27.6％和25.7％，显著减少1-0.5 mm团聚体（15.6％和12.0％）、lt;0.5-0.25 mm团聚体（24.9％和32.3％）和lt;0.25 mm团聚体（17.4％和31.8％）。与空心菜团聚体改变趋势一致，YG35、G20、YG35 EPS和G20 EPS四个处理组主要使茼蒿根际土壤gt;2 mm团聚体显著增加20.5％-26.4％，lt;0.5-0.25 mm和lt;0.25 mm团聚体显著减少了22.0％-32.1％和30.4％-45.1％；四种处理对空心菜和茼蒿较大粒径团聚体（2-1 mm）无显著影响。结果表明菌株及胞外多糖的接种可使空心菜和茼蒿根际土壤小粒径团聚体向大粒径团聚体转化，使土壤疏松程度增加，且胞外多糖单独添加与活菌直接接入无显著差异，说明活菌处理组土壤团聚体的转化主要原因是胞外多糖的分泌导致土壤之间的黏性增强，使小颗粒土壤互相交联形成大团聚体。

2.4蔬菜可食用组织Cd含量和根际土壤各项指标之间的相关性分析

土壤多糖含量与1 mm以下小团聚体比重显著负相关，与gt;2 mm团聚体比重显著正相关（图5），进一步确定了土壤多糖含量的增加增强了土壤团聚体的转化，主要是由小团聚体相互黏附形成大团聚体。空心菜和茼蒿的可食用组织Cd含量与土壤多糖含量、土壤gt;2 mm团聚体比重显著负相关，与1 mm以下的团聚体比重呈显著正相关，说明胞外多糖在减少空心菜和茼蒿吸收Cd上发挥着重要作用。

3讨论

重金属固定微生物能够抵抗外界重金属胁迫，其中芽孢杆菌在修复农田土壤重金属污染上占据着重要的地位。芽孢杆菌通过自身吸附和分泌代谢产物的方式等直接或间接地降低土壤中的重金属离子含量，胞外多糖作为一种天然的胞外多聚物，可以通过吸附、络合和沉淀作用固定重金属，还能提高微生物的金属耐受性。因此，产胞外多糖芽孢杆菌具有修复重金属污染土壤的潜力。

本研究结果发现接种菌株YG35和G20能够显著降低空心菜和茼蒿可食用组织和根部Cd含量，使茼蒿可食用组织Cd含量低于食品安全国家标准（GB2762-2017）规定的茎类蔬菜Cd限量值（0.1 mg·kg-1），且能够显著促进蔬菜的生长。该研究结果与贺卓等和Cheng等的研究结果一致，产胞外多糖的菌株能够降低辣椒／茄子果实铅的含量和促进水稻的生长。微生物释放的植物激素和其他生物活性分子能够在不利条件下影响植物的发育过程，IAA能够调节农作物的生理和代谢过程，IAA产生菌还可以作为化学肥料的天然替代品，从而有效地减少化肥的施用；铁载体是一种低分子量铁螯合物，是由土壤微生物产生的能为植物提供铁的次级代谢产物，还可以作为金属螯合剂螯合重金属离子，提高作物生产力；胞外多糖的黏性使其具有优良的保水能力，又可作为生物防治代谢物提升植物抗病能力，供试菌株YG35和G20都能产生IAA、铁载体和胞外多糖，从而缓解Cd对空心菜和茼蒿毒害作用，促进蔬菜生长发育。但目前，直接利用胞外多糖来修复重金属污染土壤的研究较少，且未见将产胞外多糖菌株与其胞外多糖钝化土壤重金属效果及机制进行对比的报道。

微生物可以通过多种机制对有毒重金属离子做出反应，其中最重要的反应之一是EPS的产生，微生物产EPS具有较大的比表面积，利用EPS丰富的官能团可以与各种重金属结合。为了研究胞外多糖钝化重金属的效果，笔者将供试菌株的胞外多糖直接施加到盆栽试验中，发现接种YG35 EPS和G20 EPS两种胞外多糖也能够缓解Cd毒性，显著促进两种蔬菜的生长，并且直接接种胞外多糖处理与活菌处理之间并无显著性差异。其原因可能有两个方面，一方面EPS可以捕获积累其他营养物质及作为微生物量碳源给蔬菜提供营养，促进蔬菜生长。另一方面EPS具有黏性，可以作为吸附剂与土壤中的Cd相互作用减少根际土壤中的有效态Cd含量，减少蔬菜对Cd的吸收，该结果也说明菌株YG35和G20钝化重金属的关键机制是胞外多糖的产生，而EPS是否能够为土著微生物提供能量，改变重金属污染土壤微生物群结构和组成还未有研究报道。

良好的土壤结构是维持农业生产力和环境质量、土壤可持续利用的基础。土壤团聚体是评价农田土壤肥力和健康的重要指标之一，可以反映土壤保水能力和通气能力，进而影响植物发芽和根系的生长。不同粒径的团聚体对重金属及其他污染物的吸附能力不同，通过分析处理前后土壤团聚体粒径比重，可以判定重金属污染土壤修复效果。接活菌与胞外多糖促使根际土壤小粒径团聚体向大粒径团聚体转化，使土壤疏松程度增加，这是由于植物根、一些氧化物、腐殖质和与金属相关的土壤多糖等可以将小团聚体相互黏合。与前人研究结果一致，产胞外多糖菌株和胞外多糖的加入可以显著提升土壤中2 mm以上粒径团聚体的比例，提升土壤性能，促进植物生长。根际土壤中有效态Cd含量与CK相比显著降低，这是由于小粒径团聚体对Cd的富集能力更强，但容易受到外力影响而迁移，而EPS会促进小粒径团聚体聚合形成不易被分散的大粒径团聚体，因此增加Cd在大粒径团聚体中的质量负载，降低了Cd向水分子的迁移和可利用性，相关性分析结果也表明多糖与土壤小粒径团聚体比例呈显著负相关，而与大粒径团聚体比例呈显著正相关。蔗糖酶活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律，其次还可以作为土壤肥力的指标，本研究中，接活菌与胞外多糖能够显著提高土壤蔗糖酶活性，表明土壤碳循环增强。其次Cd对土壤蔗糖酶活性有强烈的抑制作用，通过表征蔗糖酶活性的变化可以间接地说明菌株和多糖处理能够改善土壤Cd污染，相关性分析结果中蔗糖酶活性与土壤有效态Cd含量呈显著负相关，该结果进一步验证了该结论。

综上，菌株YG35和G20都可以降低土壤中Cd有效性，改善土壤团聚体结构，提升土壤多糖含量及蔗糖酶活性，促进空心菜和茼蒿生长，其中菌株YG35效果更佳。本研究发现直接施用胞外多糖也能缓解Cd对植物的毒性，减少蔬菜对Cd的吸收，因此，胞外多糖在修复重金属污染土壤上具有一定的应用潜力。

4结论

（1）产胞外多糖菌株Pn：estia megaterium YG35能够显著减少空心菜和茼蒿对Cd的吸收，其中茼蒿可食用组织Cd含量低于食品安全国家标准（GB 2762-2017）规定的茎类蔬菜Cd限量值（0.1 mg·kg-1）。

（2）产胞外多糖芽孢杆菌能够增加土壤多糖含量和蔗糖酶活性，促进小粒径团聚体向大粒径团聚体转化，降低茎类蔬菜根际土壤有效态Cd含量。

（3）根际土壤中施用170 mg·kg-1的胞外多糖能够显著降低茼蒿根际土壤有效态Cd含量，减少茼蒿对Cd的吸收，在重金属污染农田安全利用上有一定的应用潜力。