CXCL趋化因子在头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义

[关键词] 趋化因子； 生物信息学； 头颈部鳞状细胞癌； 预后； 免疫浸润

[中图分类号] R739.81 [文献标志码] A [doi] 10.7518/gjkq.2024012

头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamouscell carcinoma，HNSCC） 是世界上第六大最常见的恶性肿瘤，全世界每年有超过50万例HNSCC新发病例，每年有超过14万人死于HNSCC[1]。目前，治疗HNSCC的主要方法是手术切除及辅助放射和化学治疗。虽然在手术、放射和化学治疗方面取得了较大进展，但目前HNSCC患者的总生存率没有显著改善。HNSCC具有侵袭性生长、远处转移、术后复发率高、预后差的特点，其发生和发展是受多因素影响的复杂过程[2]。因此，早期诊断和有效评估预后对于改善HNSCC生存率具有重要意义。

趋化因子是细胞分泌的小分子细胞因子或信号蛋白，相对分子质量小（约810 kDa），主要由4个亚家族组成：CXC、CC、CX3C和XC，趋化因子通过与G蛋白连接的跨膜受体（趋化因子受体）相互作用发挥其生物学效应，并参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[3-4]。其中CXC趋化因子配体（chemotactic ligand，CXCL） 家族参与调节免疫细胞活性、诱导肿瘤细胞迁移、调节肿瘤细胞增殖和肿瘤微血管形成，与肿瘤的发生发展密切相关[5]。CXCL家族包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4 （PF4） 、CXCL5、CXCL6、CXCL7（PPBP）、CXCL8 （IL8）、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16和CXCL17，已有研究[6]表明部分CXCL趋化因子家族成员参与HNSCC的侵袭和转移，但CXCL家族在作为HNSCC诊断和预后标志物的作用至今尚未明确。在本研究中，通过利用相关公共数据库及R语言对CXCL在HNSCC中的表达和生存数据进行全面的生物信息学分析，阐明整个CXCL家族在HNSCC中的预后价值。

1 材料和方法

1.1 UALCAN数据库

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/） 基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）3级RNA-seq和31种癌症类型的临床数据[7]。本研究利用UALCAN数据库探讨HNSCC组织与正常组织之间CXCL的表达。Plt;0.05为差异有统计学意义。

1.2 TCGA数据库

TCGA是一项包含多种人类肿瘤致癌基因组改变的公共数据库[8]。为确定CXCL趋化因子家族在HNSCC中的表达量， 使用TCGA数据库分析CXCL家族在HNSCC与正常头颈组织中的表达量。

1.3 GEPIA网站

GEPIA（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index） 是一种新开发的交互式网站，使用标准流程处理分析来自TCGA和GTEx项目的9 736个肿瘤和8 587个正常样本的RNA测序表达数据[9]。GEPIA提供肿瘤/正常差异表达分析、根据肿瘤类型或病理分期进行分析、患者生存分析、相似基因检测、相关性分析和降维分析。

1.4 Kaplan-Meier Plotter数据库

Kaplan-Meier Plotter（ http：//kmplot.com/ analysis/）是最权威的生存分析数据库，能够评估21种肿瘤中54 000个基因与生存参数的关系[10]。本研究利用GEPIA数据库评估差异表达的CXCL在HNSCC中的预后价值，并通过K-M生存曲线验证其相关性。Plt;0.05为差异有统计学意义。

1.5 TIMER数据库

TIMER （http：//timer. comp-genomics. org/） 数据库是一种评判免疫细胞浸润及其对疾病影响的分析网站[11]。使用 TIMER数据库预测并评估差异表达的CXCL与HNSCC患者免疫细胞浸润之间的相关性。

2 结果

2.1 CXCL趋化因子在HNSCC中的表达情况

基于TCGA数据库的结果显示CXCL趋化因子在HNSCC组织与正常组织中表达的热图（图1）。与正常组织相比，HNSCC组织中CXCL8 （IL8）、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 和CXCL14高表达（Plt;0.05），CXCL12和CXCL17低表达（Plt;0.05）（图2），其余CXCL趋化因子在HNSCC组织与正常组织中的表达量差异无统计学意义（Pgt;0.05）。

在GEPIA中评估了差异表达CXCL趋化因子和HNSCC患者病理分期之间的相关性，如图3所示：CXCL9 （P=0.035）、CXCL10 （P=0.004）、CXCL11（P=0.003）、CXCL12 （P=0.02）、CXCL14（P=0.02） 的表达量在HNSCC的4个病理分期中差异有统计学意义（Plt;0.05）。

2.2 CXCL趋化因子在HNSCC患者中的预后价值

通过Kaplan-Meier Plotter数据库探讨HNSCC中CXCL趋化因子改变的预后价值，与总体生存期显著相关的趋化因子共6个，其总生存期（overall"survival，OS） 曲线如图4所示，结果表明：CXCL9、CXCL10、CXCL13、CXCL14及CXCL17高表达以及CXCL8低表达的HNSCC患者与更长的OS相关（Plt;0.05）。

2.3 CXCL 趋化因子与HNSCC患者免疫细胞浸润的相关性

TIMER数据库结果显示差异表达的CXCL趋化因子与HNSCC患者免疫细胞浸润（CD8+T细胞、CD4+T细胞、树突状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及B细胞） 密切相关，其中CXCL9/10/11/14与CD8+T细胞浸润呈正相关，CXCL12/13/17 与CD8+T细胞浸润呈负相关（Plt;0.05），CXCL9/10/11/12/13/17与CD4+T细胞浸润呈正相关，CXCL14与CD4+T细胞浸润呈负相关（Plt;0.05）；CXCL10/11/14与B细胞浸润呈正相关，CXCL12与B细胞浸润呈负相关（Plt;0.05）；CXCL8/9/10/11/12/13与中性粒细胞浸润呈正相关，CXCL14与中性粒细胞浸润呈负相关（Plt;0.05）；CXCL9/10/11/13/14与树突状细胞浸润呈正相关，CXCL17与树突状细胞浸润呈负相关（Plt;0.05）；CXCL8/12/13与巨噬细胞浸润呈正相关，CXCL10/17与巨噬细胞浸润呈负相关（Plt;0.05）；其余差异表达的CXCL趋化因子与免疫浸润无显著相关性。

2.4 HNSCC中CXCL趋化因子的功能富集分析

利用GEPIA和Metascape分析HNSCC患者中差异表达的CXCL8/9/10/11/12/13/14/17的功能、通路富集。如图5所示：基因功能主要富集在趋化因子活性（chemokine activity）、细胞趋化作用（cell"chemotaxis）、白细胞趋化性的正向调控（positiveregulation of leukocyte chemotaxis）、钙离子转运的正向调控（positive regulation of calcium ion transport）；KEGG通路主要富集在病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用（viral protein interactionwith cytokine and cytokine" receptor）、细胞因子-细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptorinteraction）、TLR信号通路（Toll-like receptorsignaling pathway） 。

2.5 HNSCC患者CXCL趋化因子的基因改变分析

通过cBioportal数据库分析差异表达的CXCL趋化因子在HNSCC患者中的突变情况，如图6所示：这些差异表达的CXCL趋化因子均发生了不同比例的突变， 其中CXCL12 突变率最高， 达到2.6%，主要包括基因扩增和突变；CXCL13/14突变率最低为0.4%。通过cBioportal数据库分析了CXCL8/9/10/11/12/13/14/17之间的相关性，结果如图6显示，以下CXCL趋化因子发生突变关系为正相关。

3"讨论

全世界每年有超过250万人患有HNSCC，每年死亡病例超过37万例[12]。HNSCC的主要治疗方法通常是手术联合放射和化学治疗，虽然在手术、放射和化学治疗方面取得了较大进展，但目前HNSCC患者的总生存率没有显著改善。HNSCC具有侵袭性生长、远处转移、术后复发率高、预后差的特点，其发生和发展是受多因素影响的复杂过程[2]。因此，早期诊断和有效评估预后对于改善HNSCC生存率具有重要意义。

趋化因子是一组结构上相关的小的相对分子质量的蛋白质[13]。这些分子在许多类型细胞的生长、分化和活化中起重要作用。趋化因子主要由白细胞合成，并通过其同源G蛋白偶联受体发挥作用，引起细胞应答，如迁移、黏附和趋化性[14]。趋化因子及其受体在肿瘤发生发展中的重要作用是调节肿瘤的转移过程。临床研究[15]证明：其中一些趋化因子能够在转移中促进肿瘤播散，包括肿瘤细胞与内皮的黏附、增殖、从血管外渗、血管生成以及保护免受宿主反应。这些蛋白质还可能简化肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME） 内恶性细胞和非肿瘤细胞之间的通讯，促进中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞的浸润和活化[16]。

本文研究结果显示：在HNSCC中趋化因子（CXCL） 存在差异性表达，其中CXCL8/9/10/11/13/14在HNSCC组织中显著高表达，而CXCL12/17在HNSCC组织中显著低表达，高表达的CXCL9/10/11/14与低表达的CXCL12同时在HNSCC的不同病理分期中的表达差异存在统计学意义，表明这些CXCL趋化因子在HNSCC的发生发展中起重要作用。有研究[17]表明：CXCL9/CXCR3轴能激活Ca127移植瘤Akt信号通路，诱导裸鼠舌鳞状细胞癌移植瘤细胞发生上皮-间质转化，介导癌细胞发生转移。通过对CXCL趋化因子生存分析发现：低表达CXCL9/10/13/14/17以及过表达CXCL8的HNSCC患者与HNSCC不良的临床结局相关，提示CXCL趋化因子可作为判定HNSCC预后的标志物。Yorozu等[18]通过对肿瘤内高表达CXCL12定量分析显示：CXCL12表达降低与较差的总生存期相关。以上研究结果表明：CXCL趋化因子对HNSCC的发生发展有一定的作用，具有作为判别病理分期及预后标志物的潜力。

本研究结果显示：差异表达的CXCL趋化因子与HNSCC 患者免疫细胞浸润（CD8+T 细胞、CD4+T细胞、树突状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及B细胞） 密切相关。Wang等[19]的研究发现：上调的CXCL9/10/11-CXCR3A轴可能与口腔白斑病和口腔鳞状细胞癌中的免疫检查点及其配体相互作用，影响口腔鳞状细胞癌CD274和IDO1的浸润。另外有研究[20]表明：过表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL） 可以下调肿瘤细胞CXCL10的分泌，减少对CD8+T细胞的趋化。CXCL12表达水平与α平滑肌肌动蛋白表达呈负相关， 并与CD8+淋巴细胞浸润呈正相关。Parikh等[21]的研究发现：口腔鳞状细胞癌细胞中较高的CXCL14表达与肿瘤生长减少以及肿瘤浸润淋巴细胞增加有关，CXCL14在淋巴结转移中下调，CXCL14介导的免疫浸润可能阻止侵袭和转移的可能性。

目前，有研究[22-23]证实：CXCL是TME的重要组成部分，CXCL及其受体可以作为化学诱导物引导免疫细胞向TME的浸润，可促进免疫识别反应，杀伤肿瘤细胞，亦可抑制免疫反应，对肿瘤的生长增殖、血管生成和转移等有一定的促进作用，对于评估新辅助免疫治疗疗效有一定的指导作用。CXCL可以参与免疫细胞发挥抗肿瘤效应，CXCL及其受体作为肿瘤免疫治疗靶点，可以指导有前景的免疫治疗策略。以上结果表明：CXCL8/9/10/11/12/13/14/17趋化因子表达与HNSCC免疫细胞浸润有关，提示CXCL趋化因子可作为HNSCC预测免疫治疗疗效的生物标志物以及作为肿瘤免疫治疗靶点。

通过对CXCL趋化因子在HNSCC中表达的功能富集分析及基因改变情况分析得出：基因功能主要富集在趋化因子活性、细胞趋化作用、白细胞趋化性的正向调控、钙离子转运的正向调控；KEGG通路主要富集在病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TLR信号通路。这就提示CXCL趋化因子对HNSCC细胞的作用主要通过以上功能及通路实现，为后续进一步验证其相关分子信号通路提供理论基础。通过基因突变分析得出差异表达的CXCL趋化因子与HNSCC发生发展密切相关，有研究[24]表明基因组扩增可作为有前景的预测分子生物标志物并且可以用于靶向治疗，本研究结果中CXCL12突变率最高，主要包括基因扩增和突变，表明CXCL12可能作为未来HNSCC患者基因治疗的潜在靶点。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。