2%甲维盐乳油对松材线虫病的防效测定

摘要：[目的]为测试2%甲维盐乳油（商品名：松高飞）对松材线虫病的防治效果。[方法]首先通过室内浸渍法比较了2%甲维盐乳油和2%甲维盐微乳剂（商品名：林源松韵）的杀线活性，然后在温室和林间通过树干注射测试了2%甲维盐乳油对松材线虫病的防治效果，最后通过高效液相色谱法测定了不同时间、不同松树体内甲维盐的含量变化。[结果]室内浸渍法结果显示，2%甲维盐乳油具有更强的杀线活性，LC50为41.808mg·L-1，显著低于2%甲维盐微乳剂的75.959 mg·L-1 （p＜ 0.05）。温室预防组结果显示，2%甲维盐乳油的预防效果显著，2a后松树无死亡。温室治疗组结果显示，2%甲维盐乳油治疗时间越早，治疗效果越好；2a后，接种线虫后7d注药治疗组，松树无死亡；而30 d后注药治疗组，白皮松、无死亡，油松死亡率为20%，华山松死亡率为40%。林间的试验显示2%甲维盐乳油在两块林地的防治效果显著，其试验组马尾松林2a累计死亡率分别为2%和5%，远低于对照组马尾松死亡率20%和25%。随着时间变化，不同松树体内甲维盐变化有所差异，华山松体内平均甲维盐含量最高（36.59 mg·kg-1），油松最低（27.11 mg·kg-1）。注射后15 d内，所有松树体内甲维盐含量均上升；15 d后，华山松树干中部甲维盐含量逐渐升高，60 d的含量最高；而油松、白皮松树干内甲维盐含量逐渐降低并趋平。[结论] 2%甲维盐乳油对松材线虫具有显著的杀线活性，温室和林间防治效果显著，在不同松树体内传输和存留效果良好，无明显药害，可以进一步推广使用。

关键词：松材线虫病；甲维盐；杀线活性；防治效果；药物残留

中图分类号：S763.1 文献标识码：A 文章编号：1001-1498（2024）05-0116-08

松材线虫病（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner et Buhrer） Nickle）是世界性检疫病害，主要危害松属（Pinus）植物，可造成松树水分输导系统受损而快速枯萎。松材线虫最早发现于北美地区，其后逐渐扩散到东亚和欧洲地区，对当地的松林造成了严重的危害，我国是目前遭受松材线虫危害最严重的国家。近年来，松材线虫的适应能力越来越强，在我国不断向北向西扩展，寄主种类也不断增加，危害对象从马尾松（P.massoniana Lamb.）、扩大到樟子松（P．sylvestrisvar. mongolica Litv.）、长白落叶松（Larix olgensisHenry）等曾经认为具有抗性的树种。目前我国大部分乡土松树树种均为松材线虫的自然感病寄主，因此，松材线虫病的防控迫在眉睫。

树干注射可以主动防治松材线虫，通过人工或者机械的手段将活性物质注入树干特定部位，nGkFth7rLZ6cEp2iS28E3g==依靠树木蒸腾作用使有效成份在树体内传导分布而发挥药效。甲维盐（全称：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐；英文缩写：EB）属于阿维菌素家族的成员之一，属于半合成高效生物杀虫剂，是目前有效防治松材线虫病的主要活性物质。甲维盐是氯离子通道激活剂，作用于γ-氨基丁酸和谷氨酸受体，导致氯离子通道异常打开，造成神经活动混乱，线虫过度兴奋和抽搐而死亡。Takai等人较早发现甲维盐对松材线虫具有高效的杀线活性，其后，围绕甲维盐分子结构的改性及剂型创制，新的甲维盐产品不断问世。Lee等人研发一种9.7%甲维盐水溶剂，可以减少使用过程中的注药量和注药孔数目；张欣伟等人：研发了一种10%甲维盐可溶粒剂，工艺简单，防效显著，对环境友好；李长强等人测试了2%甲维盐微乳剂对黑松的防治效果，药效突出；溶剂和粒剂减少了甲维盐对树体的药害，但在树体中输导效率低，容易产生沉淀，而2%甲维盐微乳剂提高了甲维盐在树体中的输导效率，但有效成份B1a含量低，防治效果不稳定。目前，市面上的甲维盐剂型多样，有效成分含量不一、防治效果差别明显。先正达（中国）集团研发的2%甲维盐乳油（松高飞）添加了特殊的助剂，含水量≤2%，有效成份B1a含量为2.3%，是较晚进入我国市场的一种剂型。为比较该款产品与国内普通甲维盐对松材线虫病的防效差异、树体中输导效率和药害等问题，本研究分析了“松高飞”与国内常用甲维盐产品的药效差异，开展了松高飞的田间防效测试。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2%甲维盐乳油（先正达集团，商品名：松高飞）、2%甲维盐微乳剂（浙江钱江生物化学股份有限公司，商品名：林源松韵）。

灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）由西北农林科技大学郭云忠教授馈赠；松材线虫（B．xylophilus）来自西北农林科技大学森林病理实验室，分离自病死的马尾松主干（陕西省汉中市佛坪县大河坝镇采集）。5年生白皮松、油松和华山松购自西安佳木秀苗木有限公司，置于温室大棚（杨凌秦岭山现代农业股份有限公司）培养，每周浇水1-2次。

1.2 林间样地

试验地位于陕西省佛坪县大河坝镇三河口村（样地1；108°2＇50＂～108°2＇58＂E，33°18＇44＂～33°18＇48＂N）、高桥村（样地2；108°2＇55＂～108°3＇2＂E，33°18＇43＂～33°18＇47＂N），亚热带气候，年均降雨1 000 mm左右；试验点海拔520 m，属于中山区东坡和北坡。两试验地均为马尾松林分，郁闭度在0.65左右，林下植被主要有短柄袍栎（Quercus glandulifera Bl.）、悬钩子（Rubuscorchorifolius L.f.）、木香（Rosa banksiae Ait.）、菝葜（Smilax china L．）等。样地1马尾松树龄40年生，胸径30～50 cm；2020年，该样地爆发过松材线虫病，间伐了大量的感病马尾松，试验前，个别松树出现了轻微的松材线虫病症状，发病率13.6%。样地2马尾松林30～40年生，边缘有个别20年生湿地松（P．palustris Engelm），树木胸径10～50 cm．生长良好，发病率11 .8%。

1.3 浸渍法测定杀线虫活性

参照李恩杰等方法，将松材线虫接种到长满灰葡萄孢菌丝的PDA培养基上，置于25℃下培养1周左右，用布袋将其培养基包裹，通过贝尔曼漏斗法分离线虫。静止24 h后，取底部水样，6 000 r·min-1离心3 min，保留底部1 mL液体。将过滤出的线虫悬浮液转移至灭菌的10 mL离心管中，分别加入1μL·mL-1氯霉素和硫酸链霉素进行表面消毒，无菌水漂洗2-3次得到无菌线虫悬浮液，置于4℃冰箱保存备用。

使用96孔板测定杀线虫活性，每次供试线虫200条。用无菌水再将2%甲维盐乳油和2%甲维盐微乳剂稀释成质量浓度为20，40，60，80，100 mg·L-1的供试药液。实验时，加入药剂和2 000条每毫升的线虫悬液各100μL，每个浓度为1个处理，每处理重复3次，以蒸馏水作为对照。处理后将96孔板置于25℃恒温箱中，24 h后用显微镜检查松材线虫的存活数和死亡数，计算死亡率和校正死亡率（式1和式2）。凡运动者或虫体呈“S”形、卷曲形、波浪形、螺旋形者均判为活虫；凡不运动且虫体呈“J”形或“C”形、或者虫体僵直、体壁无折光性者均判为死虫。为减少实验误差，在显微镜下用昆虫针刺探虫体，避免假死情况出现。

DRCK= （NDCK÷NCK）×100%（1）

DRc=（DRT- DRCK）÷（1-DRCK）×100% （2）

式中，DR表示死亡率，ND表示死亡数，～表示接种数；DRCK表示对照死亡率，NDCK表示对照死亡数，NCK表示对照供试虫数，DRc表示校正死亡率，DRT表示处理组平均死亡率。

1.4 2%甲维盐乳油的大棚温室试验

5年生白皮松、油松和华山松在温室中培养3个月后，选取健康的个体进行试验。试验分为两个处理：预防组和治疗组。预防组分别提前1 5、30和60 d，在松树干基部斜向下45°钻1个2 mm左右的小孔，在小孔外加1团灭菌的脱脂棉，将药剂按树干胸径1 mL·cm-1注射药剂；注射后，用保鲜膜密封。每个时间点、每种松树选取5棵进行试验。注药后，在注药口上方1 cm左右采用人工打孔法接种松材线虫，接种量为3 000条·株-1。治疗组先接种线虫，7、15和30 d后注射药剂，处理方式如预防组。每个处理5棵松树，以只注射药剂为阳性处理，只接种松材线虫为阴性处理。1年和2年后观察并统计处理松树的死亡率（式3）。

DR=（ND÷N） ×100％（3）

1.5 2%甲维盐乳油林间防治试验

每个林地按五点法设5个样方，每个样方抽取20棵马尾松做试验，再选取样地周边的同样数量的马尾松作为对照。用电动树干打孔注药机在树干基部斜向下45°打孔，每株树打孔3-5个，按1 mL·cm-1胸径注射2%甲维盐乳油，胸径不足20 cm的按20 cm的剂量注射。分别在1a和2a后观察并统计处理植株的存活情况，计算出每个样方的死亡率（式3），再计算两片林地的平均死亡率。

1.6 甲维盐在树体内的输导和残留含量测定

在注药7、15、30和60 d后，从5年生的白皮松、油松和华山松上采集枝条，每种松树3—5棵，在树干上、中、下部（均在注药孔以上）各取样1份。阴干后，将采集到的样品枝条剪成小段，放在50℃的烘箱中烘干，直至1 h前后质量不变。用粉碎机将烘干好的枝条粉碎，过30目筛后用密封袋置于干燥皿中保存。参照张欣伟等方法，进行样品处理、甲维盐标准品配置和高效液相色谱法（HPLC）进行检测。HPLC检测的流动相为甲醇（V）：乙腈（V）：0.1%三乙胺水溶液（V） =40：45：15，进样量为20 μL；流速为1 mL·min-1，紫外检测波长245 nm。按上述条件先测试标准品峰面积，观察出峰时间，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。再按上述条件测试各样品，每个样品测试3次。

1.7 数据处理

（1）用Excel 2019计算2%甲维盐不同剂型的毒力回归方程和相关系数，通过Origin 2021做点线图，再通过SPSS Statistics 19.0计算LC50值和LC90值。

（2）用Excel 2019整理色谱数据，做出标准曲线图，再通过SPSS Statistics 19.0进行单因素方差分析，在同种松树同一时间的条件下，对松树枝条中的甲维盐含量进行不同部位的单因素分析。同时，对不同松树同一时间的平均甲维盐含量进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同剂型甲维盐对松材线虫的杀线活性

材线虫经甲维盐药剂处理24 h后，微乳剂和乳油对松材线虫均表现出良好的杀线活性，见图1。两种剂型甲维盐随浓度的增加，松材线虫的校正死亡率上升，50 mg·L-1处理24 h后，2%甲维盐乳油和微乳剂的校正死亡率分别为98.33%和65.33%，表明两种剂型甲维盐对松材线虫均有良好的杀线活性。两种剂型甲维盐在各质量浓度下的校正死亡率均存在差异，2%甲维盐乳油在不同浓度下校正死亡率更高，表明其杀线活性更强。2%甲维盐乳油的毒力回归方程为y=1.454 1+0.988 0x，相关系数R2为0.983 4，LC50和LC90为41.808 mg·L-1和99.925 mg·L-1。2%甲维盐微乳剂的毒力回归方程为y=-4.917 4+0.701 84x，相关系数R2为0.997 6，LC50和LC90为75.959 mg·L-1和239.364 mg·L-1（表1）。2%甲维盐乳油和微乳剂的LC50的50%置信区间无交叉重合，说明2%甲维盐乳油的LC50显著低于微乳剂，而LC90的95%置信区间存在部分交叉重合，这说明2%甲维盐乳油和微乳剂的LC90差异不显著。2%甲维盐乳油对松材线虫表现出更强的杀线活性，选用其进行下一步试验。

2.2 2%甲维盐乳油大棚温室防治效果

在大棚温室内，甲维盐对不同松树的预防和治疗效果如表2所示。只注射药剂的阳性对照组均无不良生长现象，表明2%甲维盐乳油对松树无药害。阴性对照中，不同松树的死亡率不同，2a后，华山松全部死亡，油松80%死亡，白皮松20%死亡。预防组结果表明，注药15、30和60 d以后接种松材线虫，白皮松、油松和华山松虽然出现了松材线虫病的症状，但连续2a均未死亡，这表明2%甲维盐乳油可以有效预防油松材线虫病的发生。治疗组结果表明，接种线虫后注药时间越早，松树死亡率越低。先接种线虫后注射药剂，白皮松无死亡，油松接种线虫30d后注药，2a后出现了1棵死亡松树，华山松接种线虫15 d和30 d后注药，2a后死亡率分别为20%和40%。2%甲维盐乳油对不同松树的治疗效果不同，与松树种类有关。

2.3 2%甲维盐乳油林间防治效果

2%甲维盐乳油对松材线虫病的林间防治效果显著。林地1连续2a马尾松的累计死亡率为5%±3.16%，而对照区的马尾松死亡率为25%±8.94%（见表3）。林地2连续2a马尾松的死亡率为2%±2.45%，对照区马尾松的死亡率为20%±10.49%。林地2马尾松死亡率比林地1低，这可能跟林地1曾爆发过松材线虫病、清理不彻底有关。两片样地随着时间的推移，松树的死亡率增加，而注射了2%甲维盐乳油的马尾松死亡率相比对照组大幅下降，这表明2%甲维盐乳油可以有效防治松材线虫。

2.4 甲维盐在松树体内的动态分布

白皮松树干不同部位枝条的甲维盐含量变化为先升后降（图2B），树干上部枝条30 d时甲维盐含量最高，根据标准曲线（图2A）计算为46.40±1.08 mg·kg-1;中部枝条15 d时甲维盐含量最高，为43.31±0.47 mg·kg-1；下部枝条15 d时甲维盐含量最高，38.91±1.51 mg·kg-1。油松树干不同部位枝条的甲维盐含量也呈现出先升后降的趋势（图2C），但树干上部枝条15 d时甲维盐含量最高，为33.51±2.10 mg·kg-1；中部枝条30 d时甲维盐含量最高，为28.94±1.92 mg·kg-1；下部枝条15d时甲维盐含量最高，为22.06+2.08 mg·kg-1。华山松树干上部枝条甲维盐含量先升后降（图2D），15 d时最高，为49.72±2.10 mg·kg-1；中部枝条甲维盐含量一直上升，60 d时甲维盐含量最高，为43.24±1.34 mg·kg-1；下部枝条甲维盐含量先升后降，30d时最高，为38.84±1.08 mg·kg-1。

不同松树体内的平均甲维盐含量在同一时间段内存在差异，其中，油松体内的平均甲维盐含量低于白皮松和华山松，注药后15 d内表现为轻微药害现象，其7、15和30 d的平均含量与其他松树相应时间段的含量差异显著（p＜0.05）。白皮松体内平均甲维盐含量随时间变化先增后减，15 d时甲维盐含量最高，为39.45±8.50 mg·kg-1。油松体内平均甲维盐含量一直在上升，15 d前快速上升，15d后逐渐趋平，60d时为27.11±11 .23 mg·kg-1。华山松体内平均甲维盐含量总体呈上升趋势，15 d的含量最高，为38.81±10.07 mg·kg-1。甲维盐在油松、华山松体内向顶传输速度均较白皮松快，上部枝条15 d甲维盐含量即达到最大，图2；油松体内甲维盐平均含量较白皮松、华山松低，但浓度相对稳定；华山松体内甲维盐15 d后主要分布在树干中、下部，且单位含量最高，表4。

3 讨论

甲维盐是防治松材线虫主要的注干剂之一，市面上的甲维盐剂型多样，其中以乳油和微乳剂最常见，不同剂型的甲维盐的田间防治效果存在差异。乳油中具有大量的有机溶剂，对有效成分具有一定的增效作用，而微乳剂则减少了有机溶剂的使用，用水来代替有机溶剂，因而更加环保，减小了药害现象。李海等人比较了不同剂型的吡虫啉对蚜虫的防治效果，结果表明吡虫啉乳油和微乳剂对蚜虫的生物活性相当，但乳油的LC50更小。李长强和叶建仁比较了阿维菌素乳油和微乳剂对松材线虫的杀线效果，结果表明微乳剂的杀线效果显著优于乳油，其LC50和LC90的95%的置信区间无交叉重合。本试验中，2%甲维盐乳油（松高飞）的LC50显著低于微乳剂，表现出更强的杀线活性，这可能跟本研究中的2%甲维盐乳油优良的助剂系统和有效活性成分含量高有关。

甲维盐对松材线虫具有良好的防治效果。李长强等人在黑松上，按地径2 mL·cm-1的比例注干施用2%甲维盐微乳剂对松材线虫病的防治效果达91.7%。张欣伟等人发现10%甲维盐可溶粒剂的林间防治效果显著，注干施药1a后两个松材线虫病疫区的试验组马尾松死亡率为0和1.7%，对照组死亡率为6.1%和10.8%。在本试验中，2%甲维盐的林间防治效果同样显著，处理组松树死亡率明显低于对照组。松材线虫寄生在树体内，传统的叶面喷雾和土壤灌溉等施药方法效果较差，因此，树干注射是防治松材线虫的主要施药方法。相比于传统方法，树干注射的主要优势包括药剂有效利用率更高、操作过程安全性更高、对环境危害更低、对非目标生物伤害更少以及在人口密集地区施用的可能性更大等优点。树干注药方法可以分为加压式和自流式，本试验采用的是加压式注药。先使用电动树干打孔注药机先在松树主干上打孔，然后通过加压方式将药剂注入松树主干，保证药剂能够快速地注入树体木质部中。最后，用硅胶T型塞将孔洞密封，减少药剂的流失和损耗，这也可能是防效较同等浓度甲维盐微乳剂显著的原因之一。

注药后，甲维盐会逐渐被树体吸收，而后随着时间的推移，树体甲维盐浓度会逐渐降低。张欣伟等人发现，10%甲维盐颗粒剂随着时间不断被松树吸收，不断地向上传导，松树各部位甲维盐含量随着时间的延长而逐渐增加，这同本试验中施药后15 a内，2%甲维盐乳油在松树不同部位枝条中的含量均有上升趋势一致。但后期松树不同部位间差异比较大，白皮松在注射后15～30 d，上部枝梢中甲维盐含量均快速增加并达到最高值后快速衰减，而油松和华山松上部枝梢在15 d前快速增加，达到最高值后缓慢衰减；而中部枝干甲维盐含量，白皮松15 d达到最高值，后快速下降，油松30 d达到最高值后快速下降，华山松中部甲维盐含量却是随时间增加而显著增加，60 a达到最高值；下部枝干甲维盐含量，均在注射后15 d内显著增加，后逐渐减少，其中白皮松、油松甲维盐衰减较慢，15 d与30 d无显著差别，而华山松甲维盐却快速衰减。本研究的甲维盐在松树各部位中残留含量均有差异，与李长强等人运用2%甲维盐微乳剂防治黑松线虫病的研究结果基部一致。2%甲维盐乳油和微乳剂在不同松树及松树不同部位的含量动态，反应了树种吸收、传输和消解甲维盐的能力存在差异，因而，甲维盐对不同松树的松材线虫病的防治效果可能会有明显差异，使用时需要做好剂型和剂量选择。

4 结论

2%甲维盐乳油（松高飞）较2%甲维盐微乳剂（林源松韵）具有更强的杀线活性，其LC50为41.808 mg·L-1。2%甲维盐乳油对温室松材线虫病具有显著的预防和治疗作用，且田间防治效果优艮；2%甲维盐乳油在不同树体内均可以良好传输和存留、无明显的药害现象，可以作为松材线虫病的良好防治药剂。

致谢：本研究田间试验得到陕西省佛坪县林业局的大力帮助和支持，佛坪林业局康积林、西北农林科技大学彭子嘉、骆泽煜、李成龙等参与了野外注射、调查和观测，在此一并致谢！

（责任编辑：崔贝）

基金项目：2%甲维盐乳油（松高飞）对松材线虫病的防效测定（K4040121197）资助