乌汶伯克霍尔德菌P5和格氏假单胞菌RP22促杉木生长机制探究

摘要：[目的]本文拟探究乌汶伯克霍尔德氏菌P5和格氏假单胞菌RP22对杉木幼苗生长、基因表达和土壤性质的影响，初步揭示2种溶磷菌促杉木生长机制。[方法]以6个月苗龄的杉木实生苗为试验材料，将配制好的P5、RP22及P5+ RP22菌剂通过根灌方式施加，每月施加一次，持续3个月。3个月后对幼苗和土壤进行取样，测定幼苗的生长生理指标和土壤指标；基于Illumina HiSeq 4000测序平台对幼苗进行转录组分析，并筛选杉木幼苗的促生基因。[结果]与对照组（CK）相比，3种菌剂处理均促进杉木幼苗的生长。3种菌剂对杉木幼苗的促生生理机制包括：PSB提高了杉木幼苗的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白等生理指标及磷含量；同时，增加了土壤有效磷、速效钾、全磷养分含量。转录组结果表明，3种菌剂处理后杉木幼苗的差异表达基因（DEGs）均显著富集在代谢物合成、苯丙烷生物合成、亚油酸代谢、Q亚麻酸代谢和光合作用通路。对这些通路的深入分析发现，PAL、COMT、4CL、LOX1_5、AOS、AOC等基因在P5菌剂处理组显著上调；PAL、TOGT1、CYP73A、LOX15、psbS、psaF等基因在RP22菌剂处理组显著上调；LOX1_5、psb0、petH、psaF等基因在P5+ RP22菌剂处理组显著上调，表明3种PSB菌剂对杉木幼苗的促生机制是多个代谢通路相互协调的结果。[结论]3种菌剂能通过调控杉木幼苗的生理、提高土壤养分含量和上调表达苯丙烷生物合成、亚油酸代谢、光合作用等通路中的基因，从而促进杉木幼苗生长。

关键词：杉木幼苗；溶磷菌；转录组；差异表达基因；促生机理

中图分类号：S714.3 文献标识码：A 文章编号：1001-1498（2024）05-0033-13

磷是植物生长发育必须的营养元素之一，是构成酶、核酸和磷脂等生物分子的重要成分，还广泛参与植物光合作用、细胞分裂和能量传递等生理代谢活动。植物获取磷的途径主要是从土壤吸收无机磷酸盐，此外，植物还能直接吸收利用一些有机磷（甘油磷酸酯、蔗糖磷酸酯和植素等）。尽管土壤中的总磷储量较高，但植物可直接吸收利用的磷含量较少。为解决植物生长中磷缺乏问题，通常是使用化学磷肥。然而，随着化学磷肥的过度使用，远远超过了植物的吸收量，造成大量磷过剩并积累在土壤中，对土壤、水体和生态系统造成严重危害。因此，开发一种绿色环保经济的方法来提高植物对磷的利用是非常重要的。

溶磷菌（phosphate-solubilizing bacteria，PSB）是一类能溶解土壤难溶性磷的细菌，同时还有促进植物生长和增强植物抗逆的功能。PSB有多样的代谢能力，主要通过溶解不溶性无机磷或矿化有机磷来增强土壤中磷的生物有效性，从而满足植物对磷元素的需求，促进植物生长发育。PSB的种类较多，目前已知的PSB集中在厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），在属水平有假单胞菌属（Pseudomonas）、根瘤菌属（Rhizobium）、固氮菌属（Azotobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）等。此外，研究发现假单胞菌属（Pseudomonas）菌株有很强的促无机磷溶解能力，伯克霍尔德氏菌属是一类重要的溶磷菌，且普遍发现于红壤中。

杉木（Cunninghamia lanceolata （Lamb.）Hook.）是我国南方主要的用材林树种，主要分布在长江流域和秦岭以南地区，该地区具有强烈的淋溶和脱硅富铝化严重，造成大量的铁铝沉积，使得土壤中的磷极易被固定，从而有效磷含量较低，制约着杉木的生长发育。外施磷肥可以在短期内解决杉木的磷缺乏，但杉木对磷肥的利用率依然较低，且投入成本过高，不利于可持续经营。因此，发掘并分离出高效稳定的PSB菌株是解决杉木磷限制的重要途经，也对杉木人工林的可持续经营具有重要意义。本研究以江西杉木产区筛选到的两株PSB（乌汶伯克霍尔德菌P5和格氏假单胞菌RP22）为试验菌株，评价它们对杉木幼苗生长、生理、基因表达和土壤理化性质的影响，进而初步揭示2种PSB对杉木幼苗的促生机理，为杉木溶磷菌剂的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苗木为6个月苗龄的杉木实生苗，平均苗高9.92 cm，平均地径1.61 cm。供试土壤的主要成分是泥炭土、黄土、谷壳、木屑和蛭石，且每立方米基质加入3 kg缓释肥。实验所需花盆规格是8.5 cm × 15 cm（宽x高），每个花盆加入1 kg土壤。

供试菌株为本实验室从杉木人工林土壤中筛选得到的乌汶伯克霍尔德菌P5（Burkholderiaubonensis，专利号：CN202010569001.3）和从杉木根系筛选得到的格氏假单胞菌RP22（Pseu-domonasgrimontii，专利号：CN202010569008.5）.

1.2 试验设计

2020年8月-2020年11月在江西省中国林业科学研究院亚热带林业实验中心树木园进行，实验设置如下分组：施加蒸馏水为对照组（CK），施加P5菌剂，施加RP22菌剂和施加P5+ RP22混合菌剂，每个处理各60株杉木幼苗。前期试验表明菌剂稀释倍数在90倍的促生效果较好，故本试验中两种菌剂均稀释90倍后施加于杉木幼苗，将制备好的菌剂按照根灌的方式进行施加，即50 mL菌剂均匀缓慢的施人幼苗根部，对照组（CK）施加等量蒸馏水。试验共施菌剂3次（2020年8、9、10月下旬），于2020年1 1月下旬对杉木幼苗和土壤进行取样并测定。

1.3 指标测定

试验结束后，用游标卡尺和直尺分别测量幼苗地径和株高；从各处理随机选取30株平均长势的杉木幼苗，用清水洗净并去除表面杂质，滤纸吸干水分，再将其于105℃杀青0.5 h，70℃烘干至质量恒定后测定幼苗生理指标及养分指标；取一部分杉木幼苗置-80℃，进行后续转录组测序。将30个花盆中的土壤倒出并混合均匀，收集1 kg土壤带回实验室风干和过筛，用于土壤性质测定。

幼苗指标测定：凯氏定氮法测定全氮，消解—电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）测定全磷和全钾，丙酮-乙醇浸提法测定叶绿素含量，考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量，蒽酮比色法测定可溶性糖含量。

土壤指标测定：pH值采用玻璃电极法，碱解氮采用碱解扩散法，有效磷、速效钾采用碳酸铵浸提一电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）法，全磷和全钾采用消解-电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）法。

1.4 幼苗转录组测序分析

样品委托北京奥维森科技公司完成杉木幼苗总RNA提取、文库构建和上机测序。无参转录组测序分析如下：提取杉木幼苗叶部的总RNA，对提取的RNA样品分别进行RNA纯度和RNA片段长度检测。检测合格的样品将其富集得到mRNA，随后进行反转录和构建cDNA文库，最后基于Illumina HiSeq 4 000平台上机测序。

使用DEGSeq软件筛选比较组间的差异表达基因（DEGs）并统计分析，设置筛选标准：Ilog2foldchangl＞1&qvalue＜0.005。对筛选到的DEGs使用Goseq软件进行GO富集分析，并利用KEGG数据库对DEGs进行富集分析，本研究重点分析促杉木生长的DEGs。

1.5 数据分析

采用SPSS17.0对处理组和对照组的生长、生理生化指标和土壤养分指标进行方差分析，所有图均用Origin2018表制作。

2 结果与分析

2.1 对杉木幼苗生长、生理的影响

由图1可知，施加P5和RP22菌剂对杉木幼苗的促进效果不同。与CK相比，2种菌剂显著影响杉木幼苗的地径和株高，对照组（CK）的地径增量是1.07 cm，P5处理的地径增量是1.44 cm，RP22处理和P5+RP22处理的地径增量分别为1.18 cm和1.23 cm；3种处理均提高了杉木幼苗的株高增量，表现为RP22处理＞P5处理＞P5+RP22处理＞CK。

由图2可知，与CK相比，P5处理和P5+RP22处理的全氮和全钾含量均显著增加，P5处理分别增加12.69%和48.15%，P5+RP22处理分别增加23.44%和23.11%，而RP22处理下的全氮、全钾含量与CK无显著差异；3种处理在全磷含量上均是显著促进作用，P5处理提高32.47%，RP22处理提高21 .29%，P5+RP22处理提高26.03%。3种处理的可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均显著高于CK，其中P5处理的效果最好，分别增加33.04%和47.68%；RP22处理分别增加32.14%和47.92%；P5+RP22处理分别增加20.55%和38.13%。叶绿素含量，与CK相比，P5+RP22处理的影响显著，增加22.01%；RP22处理显著增加13.33%，而P5处理无显著差异。

2.2 对土壤性质的影响

由图3可知，与CK相比，3种处理的有效磷和速效钾含量均显著增加，P5处理分别增加9.72%和6.14%，RP22处理分别增加20.46%和17.72%，P5+RP22处理分别增加11.76%和18.54%；碱解氮含量RP22处理和P5+RP22处理显著增加，分别增加6.19%和7.51%；全钾含量仅有P5+RP22处理显著增加，增加了9.51%；而3种处理对土壤pH和全磷无显著影响。

2.3 差异表达基因的GO和KEGG分析

分析处理组与对照组杉木幼苗的转录数据，筛选差异表达基因（DEGs）并进行GO及KEGG代谢途径分析。P5 vs CK的DEGs是1 370个（上调754个／下调616个），RP22 vs CK的DEGs是623个（上调326个／下调297个），P5+RP22 vs CK的DEGs有732个（上调424个／下调308个）。

GO分析：由图4A可知，P5 vs CK中显著富集到分子功能的DEGs数量最多，其次是生物过程，最后为细胞成分。分子功能中富集最多的4个类别是催化活性、氧化还原酶活性、阳离子结合和金属离子结合，生物过程中富集最多的4个类别是氧化还原过程、分解代谢过程、细胞分解代谢过程和小分子生物合成过程，细胞成分中富集到最多的类别是细胞外区。图4B显示，分子功能上，RP22 vs CK中显著富集的4个类别是催化活性、氧化还原酶活性、四吡咯结合和血红素结合；生物过程上，显著富集的4个类别是细胞壁组织或生物形成、药物分解代谢过程、外部封装结构组织和细胞壁组织；细胞成分上，显著富集的类别是细胞外区。P5+RP22vsCK的GO富集分析结果（图4C）显示，分子功能显著富集的前6个类别是催化活性、氧化还原酶活性、阳离子结合、金属离子结合、辅因子结合和四吡咯结合；

生物过程上，显著富集的前6个类别是氧化还原过程、分解代谢过程、细胞分解代谢过程、药物代谢过程、光合作用和药物分解代谢过程；细胞成分中显著富集的前4个类别是细胞外区、类囊体、光合膜和类囊体部分。

KEGG富集分析结果（图5）显示，施加P5菌剂后差异基因显著富集（p＜0.05）在亚油酸代谢（Linoleic acid metabolism）、次生代谢物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、二萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）、α-亚麻酸代谢（alpha-Linolenic acid metabolism）；施加RP22菌剂后差异基因显著富集（p＜0.05）在黄酮类生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黄酮和黄酮醇的生物合成（Flavone and flavonolbiosynthesis）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoidbiosynthesis）、次生代谢物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、亚油酸代谢（Linoleic acid metabolism）；施加P5+RP22菌剂后差异基因显著富集（p＜0.05）在黄酮类生物合成（Flavonoid biosynthesis）、亚油酸代谢（Linoleic acid metabolism）、次生代谢物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）.苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）.光合作用-天线蛋白（Photosynthesis - antennaproteins）、光合作用（Photosynthesis）、黄酮和黄酮醇的生物合成（Flavone and flavonolbiosynthesis）、乙醛酸和二羧酸代谢（Glyoxylateand dicarboxylate metabolism）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（Glycine，serine and threoninemetabolism）。

2.4 促生相关代谢通路筛选及分析

在众多显著富集的通路中，次生代谢物生物合成、亚油酸代谢和苯丙烷生物合成是3个比较组中共同显著富集的通路。此外，不同菌剂处理均有特异代谢通路。

由表1-3可知，在苯丙烷生物合成通路，P5vs CK组中PAL、COMT、4CL、HCT、CCR基因均显著上调，RP22 vs CK组中PAL、TOGT1、CYP73A、E2.1.1.104、E1.11.1.7基因均显著上调，P5+RP22vs CK组中E2.1.1.104、E3.2.1.21、E1 .11.1.7基因均显著上调表达。在亚油酸代谢通路，LOX1 5基因在3个比较组中均显著上调，此外P5+RP22 vs CK组中TGL4基因也显著上调。在植物激素信号转导通路，P5 vs CK组中SAUR、AUX1、PP2C、ABF、JAZ、MYC2基因均上调，RP22 vs CK组中ARR-B、PP2C、PR1基因均上调，P5+RP22 vs CK组中PP2C基因上调。

本研究发现3个比较组均有独特的代谢通路，P5 vs CK组中Q亚油酸代谢的AOS、AOC、OPR、OPCL1、AOCX1基因均显著上调；RP22 vsCK组中光合作用的psbS、psaF基因上调，光合作用-天线蛋白的LHCB1基因上调；P5+RP22vsCK组中光合作用的psbO、psbQ、psbR、psbW、petE、petF、petH、psaF、psaG、psaN、psaO、atpG基因均是上调，光合作用-天线蛋白的LHCA2、LHCA3、LHCA4、LHCB1、LHCB4基因均是上调。

3 讨论

3.1 3种PSB菌剂促杉木生长的生理生化机制

溶磷菌能促使土壤难溶性磷向可溶性磷转化，通常也对植物生长起到促进作用。庞丽和钱婷研究发现接种PSB均显著提高马尾松和樟树的苗高及地径。本试验结果与其一致，3种菌剂处理均显著提高杉木幼苗株高和地径，可能的原因是溶磷菌改善了杉木幼苗根系的微生态环境。

溶磷菌的一系列生命活动能改善土壤养分状况，提高土壤养分及植株生长所需养分的供应量，进而促进植物生长。此外，溶磷菌也通过分泌有机酸、溶磷、固氮、释放钾等方式来促进植物生长。王同研究发现对花生接种PSB能hS+JxXgqTwYFC3y4Z8n+1A==显著提高土壤有效磷含量，促进花生地下部生长发育及花生品质。本研究结果与其相似，与对照组相比，接种PSB提高了土壤有效磷含量，从而增加植物对磷的吸收；此外，接种PSB增加了土壤的全氮含量和速效钾含量，进而促进杉木生长。

磷在植物生长代谢过程中起关键作用，王誉瑶的研究证明对玉米接种PSB会显著提高玉米的全磷含量，并显著促进玉米生长。本研究结果与其保持一致，3种菌剂处理均显著提高杉木幼苗的全磷含量。本研究中3种菌剂处理均提高土壤养分含量的供应，改善杉木对养分的吸收，从而促其生长，这与对杉木养分含量的测定结果保持一致。

可溶性糖和可溶性蛋白含量能反映植物的代谢情况，叶绿素含量是衡量植物光合作用的主要表征指标。萧利珠研究发现对山核桃幼苗接种PSB显著增加了可溶性糖和可溶性蛋白含量，陈晓琳研究发现接种高效PSB显著提高花榈木苗木的叶绿素含量。本研究得到相似的结果，3种菌剂均显著提高杉木幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量、叶绿素含量。可能的原因是接种PSB后，改善和提高杉木根系生长环境及对营养元素吸收，增加了叶绿素含量并提高植株的代谢，促使可溶性糖和可溶性蛋白在叶片中积累。

3.2 3种PSB菌剂促杉木生长的分子机制

本研究中，苯丙烷生物合成和亚油酸代谢通路是3种菌剂处理组均显著富集到的通路。苯丙烷生物合成通路中会产生木质素、花青素、黄酮等次生代谢物，这些代谢物质对植物生长发育具有重要作用。苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷生物合成的关键酶，其活性通常用来衡量植物的抗病能力，本研究发现编码该酶的APL基因在P5处理组和RP22处理组上调表达。因此，推测P5菌株和RP22菌株通过促进苯丙氨酸解氨酶的合成，从而促进苯丙烷生物合成通路中次生代谢物的合成，增强了杉木幼苗的抗逆能力，进而促进了幼苗的生长。亚油酸代谢途径中的代谢物能调控细胞膜的流动性和通透性，影响细胞膜蛋白的性质及膜上信号分子的活性，进而影响植物体内的生理生化反应。本研究中，该通路关键酶的编码基因LOX/ 5在3个处理组中均上调表达，故推测3种处理均通过影响亚油酸代谢，改变了细胞膜的流动性及通透性，间接促进了杉木幼苗的生长。相似的结果在小麦上得到证实，小麦接种Bacillus sp.wp-6后差异表达基因显著富集在苯丙烷生物合成、亚油酸代谢、α亚油酸代谢和碳代谢通路。

茉莉酸是植物体内调节生长发育的一种植物激素，能提高植物抗逆性及对环境的适应。α-亚麻酸代谢是P5处理组的特异通路，且α-亚麻酸代谢与茉莉酸（JA）生物合成密切相关，该通路的AOS、AOC、OPR、OPCL1、AOCX1基因全是上调表达。表明P5菌剂还通过影响α-亚麻酸代谢，间接影响茉莉酸的生物合成，最终促进了幼苗生长。

光合作用是植物生长发育最重要的代谢途径，杨雪研究发现接种解淀粉芽孢杆菌DGL1，燕麦的光系统1和11基因显著上调表达。本研究得到相似结果，RP22 vs CK组中psbS、psaF、LHCB1基因上调，P5+RP22 vs CK组中psb0、psbW、petE、psaF、psaG、atpG、LHCA2、LHCA3、LHCB4等基因均上调表达。表明RP22菌剂促使光合作用相关基因上调表达，从而增强杉木幼苗的光合作用，最终促进幼苗生长。

2种菌剂及复合菌剂对杉木生长情况和杉木的基因表达存在差异，这可能是两种菌株的生理特性、定殖能力和菌种间的互作特性所造成。3种菌剂处理除了共同影响的代谢通路，各自还有特异通路。P5菌剂会影响亚油酸代谢，而RP22和复合菌剂能够使得光合作用相关基因上调表达，表明两种菌剂对杉木促生机理存在差异，有待进一步研究。

4 结论

3种PSB菌剂均显著促进杉木幼苗的生长，显著提高杉木幼苗可溶性糖、可溶性蛋白含量及磷的吸收，同时显著增加土壤有效养分（有效磷和速效钾）。转录组分析表明促进杉木幼苗生长的代谢通路主要是次生代谢物生物合成、苯丙烷生物合成、植物激素信号转导等通路，且促生基因为APL、LOX/5、psaF、LHCB1等基因。本研究结合生理生化指标和转录组数据，从生理生化和分子水平揭示3种PSB菌剂的促生机制，进而深入理解P5和RP22菌株促杉木幼苗生长的作用机制。

（责任编辑：张研）

基金项目：林业和草原科技成果国家级推广项目“高效多功能菌剂在杉木大田育苗中的推广应用”（2023133101）