一种集成细胞应力加载模块的载物台培养器设计与应用

摘 要：力学刺激下活细胞行为变化对于生物学和医学具有重要意义，而常规细胞培养装置难以同时实现细胞应力加载下的实时观测。该文提出将基于负压控制的细胞应力加载与细胞培养和动态观测进行原位集成，设计制造集成化载物台培养器，并进行实验验证。结果表明，该装置能够通过设定细胞基底应变量，实现细胞在特定应力加载下的持续培养与实时监测。该文为集成化载物台细胞培养装置的设计制造提供有效技术方法。

关键词：细胞培养；细胞应力加载；Arduino程序开发；自动化设计；有限元仿真

中图分类号：Q274 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2024）31-0012-05

Abstract： Changes in the behavior of living cells under mechanical stimulation are of great significance to biology and medicine， but it is difficult for conventional cell culture devices to simultaneously realize real-time observation of cells under stress loading. This paper proposes to integrate cell stress loading based on negative pressure control with cell culture and dynamic observation in situ. An integrated stage incubator is designed and manufactured， and experimental verification is carried out. The results show that the device can achieve continuous cultivation and real-time monitoring of cells under specific stress loading by setting the strain on the cell substrate. This papeBb9C2t6sEZhNXWDsDlUCww==r provides an effective technical method for the design and manufacture of integrated stage cell culture devices.

Keywords： cell culture; cell stress loading; Arduino program development; automated design; finite element simulation

对细胞进行体外培养和实时显微观察具有重要意义[1-2]。目前在国内外各类细胞培养箱装置中，衍生出了一种可以在培养细胞的同时进行实时显微图像采集的产品，即活细胞工作站[3-4]。该装置基于倒置显微镜和相机，构建配套的小型细胞培养箱，可动态观察活细胞行为。生物体内细胞生长、增殖、凋亡和迁移等生物学过程都会受到力学因素影响[5-8]。作为生物力学中的前沿领域[9]，细胞力学的其中一项研究目的是通过对细胞生长的环境施加各种力学因素[10]，观察细胞对力学刺激的响应[11-13]。然而，此类活细胞工作站产品成本较高，且不利于直接集成对细胞的应力加载装置，限制了在大量常规实验室的应用。

牵张应力是生物体内最常见应力，研究其作用下细胞的生理变化对生物学和医学具有重要意义，是近年研究的热点[10，14]。负压加载技术将弹性薄膜基底下方的封闭空间抽气产生负压，使薄膜上方和下方产生压力差，从而发生形变实现牵张应力加载。目前的负压加载装置能够控制基底应变量[15]，但未实现与培养装置的集成。本文提出将基于负压加载的细胞应力加载与细胞培养和动态观测功能进行原位集成，能够同时满足体外培养、显微观察拍照、应力加载等需求，并进行了实验验证。

1 载物台式微型细胞培养器的结构设计

载物台式微型细胞培养器腔室的三维设计如图1（a）所示，其三维模型俯视图如图1（b）所示。孔1安装传感器及其套筒；孔2为CO2进气孔；孔3—孔6为发热片和微型风扇导线孔；孔7为温度传感器导线孔；孔8为M5螺纹孔，分布于4角，用于密封连接。箱体底面设有一凹槽用来安装培养板支架，并通过7个M3的螺纹孔（孔9）固定；培养器内部底面设有凹槽10—凹槽12，用于与3块夹层板配合。

2 细胞应力加载模块设计

2.1 应力加载装置设计

本设计采用负压加载法来对细胞施加牵张应力，加载系统如图2（a）所示。真空泵和电磁阀打开时（N1和N2连通），真空泵抽气使封闭空间内形成负压，使弹性基底产生形变，实现细胞应力加载。

负压加载装置实物图和三维模型剖面结构图如图2（b）所示：去除多孔培养板内某个培养孔的底面，将弹性基底薄膜贴固在培养孔中空的下底面上，使用法兰装置与螺栓和螺母配合将弹性基底薄膜压紧。细胞接种在薄膜上方，其在上表面贴壁生长。使用波纹软管将法兰与显微镜镜头连通并密封，软管侧壁上出气孔与气压传感器舱室的进气孔相连。待细胞贴壁生长之后，使用真空泵抽气，封闭空间内的气压低于弹性基底薄膜上方的标准大气压，在气压差作用下弹性基底薄膜发生形变，其上方贴壁生长的细胞也相应地发生形变，产生牵张应力。细胞应力加载模块的控制流程如图3所示。

2.2 弹性基底选取及参数计算

本文使用聚二甲基硅氧烷材料（PDMS）作为弹性基底[16-17]。不同混合比制成的PDMS具有不同的力学性质，PDMS基液与其固化剂以10∶1的质量比混合时，其弹性模量E为2.25 MPa，泊松比μ为0.49，本文使用的 PDMS薄膜厚度为0.2 mm。使用圆形基底拉伸法[18]进行牵张应力加载时，圆形基底在外部气压作用下会凹陷为球冠状，如图4（a）所示，其中，圆形PDMS薄膜的总半径R0为15 mm，厚度h为0.2 mm，除去被压紧的部分，可进行应力加载的圆形部分的半径R1为10.4 mm，其圆心位置在垂直方向的位移为t，球冠半径为R2，α为球冠张角的1/2，Pa为培养器内PDMS薄膜上方的气压，Pb为PDMS薄膜下方封闭空间的气压。

根据圆形薄膜应变的计算方式[19]，计算出PDMS薄膜的拉伸应变

式中：S1和S2分别为薄膜加载前、后的有效表面积。根据PDMS薄膜及力加载孔结构的几何特征，可计算得出

加载后PDMS薄膜应力即近似为贴壁细胞受到的应力σ。由图4（a）可知，PDMS薄膜在竖直方向受到的合力F3等于细胞及其培养基的压力F1和薄膜上方和下方的气压差施加的压力F2之和，即

F3=F1+F2 。 （3）

其中，PDMS薄膜上方的气压为Pa，薄膜下方的气压为Pb，所以

式中：R1=1.04×10-2 m，F1=9.898×10-3 N，E=2.25×106 Pa，μ=0.49，Pa=101 325 Pa，h=2×10-4 m，π=3.14。

将以上参数值代入式 （8） 中可以得到

σ=72 860.329 59R2+2 500×R2（101 325-Pb）。 （11）

将参数值和式（11）代入式（9）中得到

ε=1.651 50×10-2R2+5.666 67×10-4R2（101 325-Pb）。（12）

将参数代入式（10）中可以得到

t2=1.786 26×10-6R2+6.129 07×10-8R2（101 325-Pb）。（13）

至此，求出了σ、ε、t与Pb、R2的关系。

将细胞所受的拉伸应变ε取5%代入式（2）可得到PDMS薄膜中心点在垂直方向的位移t，然后结合式（11）—式（13），得出t=2.326×10-3 m，R2=2.441×10-2 m；Pb=97 739 Pa，F3=1.227 78 N。

2.3 PDMS薄膜的有限元分析

本文使用有限元分析软件ANSYS（试用版）对PDMS薄膜加载形变之后的位移和应力情况进行研究。本文建模仿真了5%应变状态下PDMS薄膜的位移和应力分布图（图4）。位移量从PDMS薄膜四周至中心递增，在中心位置达到最大。四周和中心应力最大，从四周到中心应力先减小后增大（图4（b）和图4（c））。

2.4 系统硬件配置与程序设计

为了测量和控制气压值Pb，本文选择STM8L051F3气压传感器，其以一定的频率输出气压值（例如0.5 s 或者1 s）。选取上海卡默尔流体科技有限公司的KVP04微型真空泵进行抽气，选择CDG1-1DD固态继电器控制气路三通电磁阀（型号FA0520F，图中省略了电磁阀），如图5所示。固态继电器B为扩展部件，用于控制其他气体管路的电磁阀。Arduino控制板从气压传感器中读出数据，同时通过控制真空泵转速调节气压Pb，从而控制薄膜的形变。

3 试验

3.1 细胞体外培养试验

本文使用P5代小鼠成肌细胞（C2C12细胞）进行试验。将传代后的细胞在ICW190培养箱内培养12 h后，移入到微型培养器腔室内（图6（a））。图6（b）为12孔培养板示意图。图6（c）为细胞原位培养器装置整体图。通过72 h细胞生长测试，发现B2、B3和B4孔的细胞贴壁黏附率和生长速率达到最佳状态。因此，之后使用B3孔进行后续试验。

3.2 细胞应力加载试验

应力加载试验使用12孔细胞培养板的B3孔进行，将传代后的细胞植入载物台式微型细胞培养器中培养12 h，待其充分贴壁，以使得力学刺激可以通过弹性基底传导至细胞，之后开始进行应力加载，使用5%的薄膜应变量进行加载，即在ArduinoIDE中设定目标气压值为97 739 Pa，加载周期为每15 min加载5 min，连续加载10 h，并每隔1 h进行显微拍照。应力加载结果照片如图7所示。为了进行对比，本文还进行了无应力加载的对照组实验，对照组实验同样使用12孔培养板的B3孔进行，将传代后的C2C12细胞放入常规ICW190培养箱中培养12 h后移入本装置培养10 h，细胞生长情况如图7所示。

对比图7中有/无应力加载情况下的结果照片，经过PDMS薄膜形变加载10 h的细胞相对更细长，存在更多成球形的细胞，也出现了相对多的碎片，而无应力加载（对照组）细胞较为饱满，单个细胞的黏附面积更大。可证明5%薄膜应变状态下的应力加载对细胞产生了一定的刺激。试验结果验证了载物台培养器内集成化细胞应力加载模块的功能。

4 结论

本文设计并制作了一种小型化载物台细胞体外培养系统，该系统同时集成了微型细胞培养器模块、细胞应力加载模块及细胞生长状态图像自动采集模块，进行了相应的应变应力分布的模拟，并使用小鼠成肌细胞进行了应力加载试验，验证了本系统内各项功能的可行性。

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