一种检测牛奶中喹诺酮类药物的高效液相色谱-串联质谱方法

摘 要：本文基于高效液相色谱-串联质谱建立了一种高精密度检测牛奶中喹诺酮类药物的方法，并对所建立的方法进行了方法学的考察与验证。本研究参考已有的标准，对标准的前处理步骤进行优化，最后采用高效液相色谱-串联质谱进行分析。20种喹诺酮类药物的标准曲线相关系数为0.995 59～0.999 91，方法检出限为0.051 4～0.928 μg/kg，回收率为73.6％～110.0％，相对标准偏差为1.33％～7.69％。该方法前处理简便、高效，所得结果检出限低，回收率较好，精准度高，重复性好，可以为检验牛奶中喹诺酮类药物提供有力的方法支撑。

关键词：喹诺酮类药物；高效液相色谱-串联质谱；高精密度；高回收率

中图分类号：TS252.7 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2024）05-0081-08

喹诺酮类药物是一种具有抗菌谱广、抗菌力强、价格低廉等特点的人工合成抗菌药，其作用机制是抑制DNA回旋酶发挥作用，导致mRNA与蛋白质合成失控从而达到杀死细菌的目的[1]。常见的喹诺酮类药物有诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等，常用于预防和治疗畜禽细菌性疾病[2]。但这也不可避免地导致药物在动物体内残留，继而经口摄入进入人体，对人类健康产生不良影响[3]。喹诺酮类药物可对人体造成多系统的不良反应，包括胃肠道不适、中枢神经系统不良反应、肌腱炎及反应性关节炎、影响软骨发育以及肝脏损伤等[1，4]。

牛奶是日常生活中十分常见的饮品，含有丰富的蛋白质、脂肪等，具有很高的营养价值。牛奶在生产、运输、包装到销售的过程中均存在被污染的可能，从而对人体健康产生不良影响。其中抗菌药滥用导致的药物残留是不容忽视的问题，而牛奶中喹诺酮类药物的残留现象较为普遍，已成为一个严重的食品安全问题[5]。因此，建立准确测定牛奶中喹诺酮类药物残留的方法至关重要，对保障牛奶等乳产品的食品质量安全和降低健康风险具有重要意义。目前，牛奶中喹诺酮类药物的检测方法主要有免疫学方法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）等[6-8]。其中高效液相色谱-串联质谱法对复杂样本的分离能力和定性效果好，可同时检测多种药物残留，具有选择性和灵敏度高的特点，应用广泛[9]。

现存大多数研究检测的喹诺酮类药物种类较少，不够全面；现行国家标准GB 29692—2013《牛奶中喹诺酮类药物残留量的测定 高效液相色谱法》也只规定了11种喹诺酮类药物的测定方法[10]。因此，有必要开发一个包括更多种类药物的测定方法。本研究以牛奶为样本，在国家标准的基础上进行优化，建立简便、快速、可重复性高的前处理方法，采用高效液相色谱-串联质谱法对样本中的依诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、麻保沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西诺沙星、奥比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星以及氧氟沙星这20种喹诺酮类药物进行准确的定性定量检测，以期为喹诺酮类药物的检测提供有力的方法及技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Aglient 1290超高效液相色谱仪，美国AB Sciex Triple Quad™ 5500质谱仪，OAN-EVAP 24型全自动氮吹仪，日本TAITEC Mix-VR多管漩涡混合仪，梅特勒AG285型天平，IKAKS501型旋涡混合器，德国Sigma 3K15冷冻离心机，Millipor超纯水仪，新芝SB-1200DT型超声波清洗机。

1.2 材料与试剂

乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；0.2％甲酸甲醇溶液（V甲醇∶V甲酸=100∶0.2）；甲醇水溶液（V甲醇∶V水=1∶1）。

QuEChERS缓冲盐试剂袋；Waters PRIME HLB（6cc 200 mg）固相萃取柱；快速定量滤纸。

1.3 样本制备

量取适量牛奶，装入洁净容器作为试样，密封并标记，放置于－18 ℃冰箱中备用。

1.4 标准溶液的配制

准确称取20种喹诺酮类药物（依诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、麻保沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西诺沙星、奥比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）标准品，用甲醇分别配成1 000 μg/mL的标准储备液，－20 ℃冰箱中保存，有效期 12个月；分别移取适量1 000 μg/mL的标准储备液于同一容量瓶中，用甲醇稀释成100 μg/mL混合标准溶液，－20 ℃冰箱中保存，有效期6个月；再移取100 μg/mL混合标准溶液稀释为10 μg/mL的混合标准工作液。

1.5 样本前处理

准确称取试样5.00 g于50 mL离心管中，加入0.2％甲酸甲醇溶液10 mL，涡旋混匀后振荡5 min，超声提取5 min，5 000 r/min 离心5 min，收集上清液；向上清液中加入QuEChERS缓冲盐试剂袋，充分涡旋混合1 min后，5 000 r/min离心10 min，取上清液过快速定量滤纸，所得滤液收集备用。

移取上述滤液4.0 mL，过PRIME HLB固相萃取柱洗脱，准确移取2.5 mL洗脱液至15 mL离心管内，在40 ℃水浴下氮气吹干，再用甲醇水溶液（体积比1∶1）定容至1.00 mL，涡旋后过0.22 μm滤膜，待HPLC-MS/MS分析。

1.6 HPLC-MS/MS条件

1.6.1 高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A相为0.1％甲酸水溶液；流动相B相为甲醇；柱温为40 ℃；进样量5.0 μL。梯度洗脱程序见表1。

1.6.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压为5 500 V；离子源温度为600 ℃；气帘气压力为28 psi；碰撞气压力为10 psi；雾化气压力为55 psi；辅助加热气压力为60 psi。

定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表2。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

按方法条件设置仪器参数，16种喹诺酮类药物（依诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、麻保沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西诺沙星、奥比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星）配制浓度为1.00、2.00、20.00、100.00、200.00、300.00 ng/mL的混合标准工作溶液，其余4种喹诺酮类药物（诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）配制浓度为1.00、2.00、4.00、20.00、40.00、60.00 ng/mL的混合标准工作溶液，待仪器参数稳定后，对系列标准样本溶液进行测定，绘制标准曲线，相关系数r的范围为0.995 59～0.999 91。具体见表3。

2.2 方法检出限确定

以空白牛奶样本为基质，做7个平行添加试验，阳性添加20种喹诺酮类药物的浓度均为0.500 0 μg/kg，按照1.4方法进行前处理，进行上机测定，测得方法检出限范围为0.051 4 ～0.928 0 μg/kg，具体见表3。计算公式如下：

检出限（μg/kg）=K·Sb·C/X

式中：K取3；Sb为平行测试样含量的标准偏差；C为加标浓度，μg/kg；X为平行试样含量的平均值。

2.3 回收率及精密度确定

以空白牛奶样本为基质，向牛奶样本中添加16种喹诺酮类药物（依诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西诺沙星、奥比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星）项目混标0.5、10.0、100.0 μg/kg浓度水平，其余4种喹诺酮类药物（诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星）项目混标0.5、2.0、20.0 μg/kg浓度水平进行加标回收试验。按照方法进行前处理，上机测试，结果如表4及表5所示。

根据表4与表5中相对标准偏差和回收率结果可发现，该方法的相对标准偏差较低，且回收率表现较好，回收率为73.6％～110.0％，相对标准偏差为1.33％～7.69％。该方法的检出限较低，同时重复性较好，并且能保持较为优异的回收率，可用于20种喹诺酮类药物的准确定性、定量检测。

3 结论

本研究在现存标准的基础上，对牛奶中喹诺酮类药物的前处理过程进行了优化：纯化步骤采用QuEChERS缓冲盐试剂袋对样本进行初纯化，同时缓冲盐能够更好地平衡提取体系的pH和防止样本乳化；使用PRIME HLB小柱进行进一步纯化，可以进一步降低基质干扰。在高效液相色谱-串联质谱的分析中也得到了较为满意的回收率、稳定性和精密度结果。因此，本研究建立了一种基于高效液相色谱-串联质谱检测牛奶中喹诺酮类药物的简便测定方法，为相关行业检测工作提供了检测方法及技术参考。

参考文献

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[10] 农业部，卫生和计划生育委员会．食品安全国家标准 牛奶中喹诺酮类药物多残留的测定 高效液相色谱法：GB 29692—2013[S]．北京：中国标准出版社，2014.

作者简介：韩银涛（1982－ ），男，学士，高级兽医师，主要从事动物疫病预防控制相关工作；E-mail：18738294@qq.com

共同第一作者：庞李艳（1991－ ），女，学士，兽医师；E-mail：348776239@qq.com

*通信作者：次仁玉珍（1994－ ），女，学士，助理兽医师；E-mail： 2449552533@qq.com

吴凯（1991－ ），男，学士，助理兽医师；E-mail： 465358852@qq.com