佛罗里达文昌鱼哈氏窝组织在性腺发育不同时期的形态结构变化

摘 要：哈氏窝是文昌鱼生殖内分泌调控轴重要组成部分，为了进一步揭示文昌哈氏窝形态特征与性腺发育的关系，丰富文昌鱼的生物学基础信息，利用组织学切片及HE染色技术观察了佛罗里达文昌鱼在性腺发育不同时期哈氏窝形态变化。结果表明：佛罗里达文昌鱼在性腺刚出现及早期时，哈氏窝位于文昌鱼哈氏窝位于脊索附近，有一层薄膜相隔，呈近似对称的倒“凹”状；在性腺发育和成熟时期，哈氏窝顶部增厚，胞质清晰，两侧向窝内增大，窝内空隙变小，形状呈现矮宽；在性腺排空及退化时期，哈氏窝两侧呈细长状，窝内空间狭窄。

关键词：佛罗里达文昌鱼；哈氏窝；石蜡切片；组织学观察

中图分类号：Q954.6 文献标志码：A 文章编号：0253−2301（2024）07−0017−04

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.07.003

Morphological and Structural Changes of Hatschek's Pit Tissue in Branchio-stoma floridae atDifferent Stages of Gonadal Development

CENWan，WURui-qiong，YANGLi-cheng，HUANGZhen

（1.College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China;2.Innovation and Transformation Center， Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： Thehatschek'spitisanimportantcomponentof thereproductiveendocrineregulationaxisinAmphioxus.Inordertofurtherrevealtherelationshipbetweenthemorphologicalcharacteristicsofhatschek'spitandgonadaldevelopmentofAmphioxus，andenrichthebiologicalbasicinformationofAmphioxus，themorphologicalchangesofhatschek'spitatdifferentstagesofgonadaldevelopmentofBranchio-stoma floridae wereobservedbyusingthehistologicalsectionandHEstainingtechnique.TheresultsshowedthatwhenthegonadsofBranchio-stoma floridaeappearedatthebeginningandearlystageofdevelopment，thehatschek'spitwaslocatednearthenotochordofAmphioxus，withathinfilmseparatingit，forminganapproximatelysymmetricalinverted"concave"shape.Duringthedevelopmentandmatureperiodofgonads，thehatschek'spithadathickenedtop，clearcytoplasm，enlargedonbothsidestowardsthepit，smallergapswithinthepit，andashorterandwidershape.Duringtheperiodofgonadalemptyinganddegeneration，thetwosidesofthehatschek'spitwereslenderandthespaceinsidethepitwasnarrow.

Key words： Branchio-stoma floridae；Hatschek'spit；Paraffinsectioning；Histologicalobservation

文昌鱼Amphioxus属于脊索动物门、头索动物亚门、头索纲，是无脊椎动物与脊椎动物的中间态，有着脊索动物的三大特征：有鳃裂、神经管和脊索，可以提供有关脊椎动物起源和演化的重要线索[1]。常见的文昌鱼有佛罗里达文昌鱼Branchio-stoma floridae、白氏文昌鱼Branchiostoma belcheri、日本文昌鱼Branchiostoma. japonicum等。目前佛罗里达文昌鱼的基因组已经被发表，结果显示文昌鱼的基因组演化速率相对较慢，其保留了与现代脊椎动物相似的身体结构[2]。

文昌鱼的哈氏窝（Hatschek'spit）属于轮器的一部分，起源于内胚层或外胚层，位于口腔顶部，是个凹坑结构[3]。哈氏窝因在文昌鱼的摄食机制中发挥作用[4]而引起了特别的关注，因为它与被囊动物和脊椎动物的多种结构同源，目前认为它对应于脊椎动物的垂体。Drach[5]也提到了哈氏窝和环口动物垂体管之间的特殊同源性关系。我国科学家发现了文昌鱼存在原始的生殖内分泌调控轴、脑-哈氏窝-性腺轴，与脊椎动物脑（下丘脑）-脑垂体-性腺轴相似，该轴调节文昌鱼性腺发育成熟及其生殖活动[6−8]。因此，剖析文昌鱼哈氏窝的发育特征为探索器官的生理功能和演化历程提供了的线索，具备一定的研究价值。本研究通过组织学切片的技术手段观察不同发育时期的哈氏窝形态，为佛罗里达文昌鱼发育生物学和哈氏窝结构的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

试验中佛罗里达文昌鱼Branchiostoma floridae是实验室科研引进后人工饲养繁育的子三代。收集性腺发育早期（性腺刚开始、性腺分化早期）、发育中期（性腺发育中、性腺成熟）、发育后期（性腺排空、性腺退化完整）的文昌鱼。

1.2哈氏窝组织切片制备

整只文昌鱼置于质量分数4%的PFA（多聚甲醛）溶液中，4℃条件下固定24h。固定完成后，将样品置于体积分数为30%、50%、70%、90%和100%酒精中进行梯度脱水，充分脱水后的组织经二甲苯透明和石蜡包埋，制备成为蜡块，之后进行石蜡切片，切片厚度为8μm。

1.3苏木精-伊红染色（H.E染色）

将石蜡组织切片置于烘箱（60℃）中烘烤30min，经二甲苯、酒精梯度脱蜡和复水，随后用苏木精-伊红染色，再次梯度脱水后用中性树脂封片。

1.4显微观察

待树脂干后通过显微镜（ZeissAxioZoom.V16）进行观察，运用软件ZEN2Pro进行图像采集。

2 结果与分析

2.1佛罗里达文昌鱼性腺发育初期的哈氏窝形态

在性腺刚出现的文昌鱼中，通过解剖，在脊索中线侧下方能观察到倒“凹”型的哈氏窝组织。左右近似对称，哈氏窝顶部与脊索以一层薄膜相连，仅有薄薄的上皮构成哈氏窝初型，其窝内空隙大。通过HE染色观察发现，哈氏窝的细胞核呈圆形（图1a、1a′）。当文昌鱼发育至性腺早期时，哈氏窝顶部体积增大，两侧逐渐成形，以细长状为主向窝内突起，并且在靠近哈氏窝底部开始出现细小纤毛，具有致密细胞核，核与核间堆叠，核数目增多，胞质较少（图1b、1b′）。

2.2佛罗里达文昌鱼性腺发育中期的哈氏窝形态

在佛罗里达文昌鱼性腺逐渐成熟的过程中，通过取样观察可以看到，哈氏窝顶部组织继续增厚，细胞核由圆形转变为细长形，且排列紧密，胞质清晰，两侧向窝内增大，窝内空隙变小（图2a、2a′）。至性腺发育成熟时，哈氏窝顶部没有明显改变，两侧向哈氏窝顶部回缩，不再向窝底部方向增大，形状呈现矮宽，但继续向窝内增厚，纤毛变长并排列有序（图2b、2b′）。

2.3佛罗里达文昌鱼性腺发育晚期的哈氏窝形态

当佛罗里达文昌鱼处于性腺排空时期，可以在切片中观察到哈氏窝两侧逐渐变回细长状，仍有纤毛存在，窝内变得狭窄（图3a、3a′）。当性腺退化后，哈氏窝细胞核排列紧密，形态几乎与性腺排空时期相差不大，仅有窝内空间增大（图3b、3b′）。

3 讨论与结论

在文昌鱼哈氏窝的相关研究中，通常把哈氏窝的凹槽作为识别标志。在本研究中同样显现了凹槽的哈氏窝，并从组织学上对不同性腺发育时期的佛罗里达文昌鱼哈氏窝发育规律进行了探索。结果表明文昌鱼哈氏窝位于脊索附近，有1层薄膜相隔，呈近似对称的倒“凹”状。在性腺不断发育过程中，哈氏窝两侧逐渐增厚，由细长型转为矮宽型，体积不断向窝内变大，于后期再次转为细长型且体积缩小，哈氏窝顶部变化不大。同样地，Gorbman[9]等发现只有1层薄薄的透明基底膜状将哈氏窝与相邻的组织分开，并且凹槽结构虽不完全对称，但仅有些许差距。而哈氏窝的窝内空隙，因哈氏窝两侧体积变化而变化，当哈氏窝两侧体积增大后，窝内空隙就变小，反之，空隙变大。另外哈氏窝具有致密的细胞核，并且核的数目随着发育进行而增多，直至发育成熟后便不再增多，核形状也由最初的圆形至中期开始转为细长形。文昌鱼哈氏窝是由3种类型的细胞所组成，分别为：位于顶部的上皮细胞、位于中间的不规则细胞以及位于底部（近口腔）的纤毛黏液细胞[10]。而在本研究中，也发现了纤毛的存在，纤毛不断变长并有序排列。

文昌鱼的生殖内分泌调控系统（脑泡-哈氏窝-性腺）能够调控性腺发育、成熟及生殖活动等[11]。佛罗里达文昌鱼哈氏窝发育变化可能与水温有关，哈氏窝位于口腔顶部，与水流相通，对于水温敏感，接受到刺激后，传入神经刺激端脑中类似GnRH系统，紧接着该神经元发出纤维到达哈氏窝，促使哈氏窝逐渐发育合成多种脊椎动物腺垂体激素[12]，调控文昌鱼的性腺发育。本试验对佛罗里达文昌鱼哈氏窝发育进行了初步探究，为佛罗里达文昌鱼哈氏窝发育的后续研究奠定了基础。

参考文献：

[1]方永强.文昌鱼哈氏窝结构与功能研究进展［J］.生物学通报，2002，37（6）：4−5.

[ 2] BI C， LU N， HUANG Z， et al. Whole-genome resequencing revealsthepleistocenetemporaldynamicsofBranchiostomabelcheri and Branchiostoma floridae populations［ J］ . Ecology and Evolution，2020，10（15）：1−15.

[ 3] 方永强，翁幼竹，胡晓霞.文昌鱼内柱结构与功能及其神经内分 泌调节［J］.自然科学进展，2002（10）：1090−1093.

[ 4] HATSCHEK B. Mitteilungen fiber Amphioxus［ J］ . Zool Anz， 1884，7：86−127.

[ 5] DRACH P. Embranchcment des Cephaloeordes［ J］ . Traite de Zoologic，1948（11）：65−70.

[ 6] 方永强.文昌鱼生殖内分泌生理学研究进展［J］.生物学通报， 1995，30（4）：4−5.

[ 7] 方永强，翁幼竹.文昌鱼幼虫变态的内分泌调节研究进展［J］. 应用海洋学学报，2015，34（3）：100−103.

[ 8] TJOY L， WELSCH U. Electron microscopical obse-rvations on Kolliker'sandHatschek'spitonthewheelorganintheheadregionof amphioxus（ Branchiostomalanceolatum）［ J］ . Cell T issue Res， 1974，153：175−187.

[ 9] GORBMANA，NOZAKIM，KUBOKAWAK.ABrain-Hatschek's Pit Connection in Amphioxus［ J］ . General & Comparative Endocrinology，1999，113（2）：251−253.

[ 10] 方永强，齐襄.文昌鱼哈氏窝上皮细胞超微结构的研究［J］.中 国科学：B 辑，1989（6）：592−595.

[ 11] 方永强.文昌鱼在生殖内分泌进化中的地位［J］.科学通报， 1998，43（3）：225−232.

[ 12] 翁幼竹，刘志刚，方永强，等.水温对文昌鱼生殖活动的影响及 其内分泌机制［J］.海洋学报，2012，34（4）：9−11.

（责任编辑：柯文辉）