骨髓增生性肿瘤病人JAK-2和CALR基因表达及其与预后关系

［摘要］目的探讨骨髓增生性肿瘤（MPN）病人JAK-2和CALR基因表达及其与预后的关系。

方法选取2018年7月—2022年7月石家庄市人民医院收治的38例MPN病人纳入研究组，另选取本院无血液系统疾病志愿者40例纳入对照组，采用实时荧光定量PCR技术检测两组骨髓液JAK-2与CALR基因表达。根据预后评价标准将研究组再分为低危组、中危组及高危组3个亚组，比较各亚组病人JAK-2与CALR基因表达，并采用Spearman相关性分析两基因表达与预后的关系。

结果相较于对照组，MPN各亚组JAK-2与CALR基因表达显著升高（F=278.674、615.206，P<0.05），其中以原发性血小板增多症的两基因表达最高。随着预后评定级别由低危组到高危组转变，MPN病人两基因表达逐渐升高，且Spearman相关性分析显示，两基因表达均与病人预后呈显著负相关（r=－0.491、－0.503，P<0.01）。

结论MPN病人JAK-2与CALR基因表达异常升高，且其表达水平与预后呈负相关，临床可据此评估MPN病人的疗效及预后。

［关键词］骨髓肿瘤；原发性骨髓纤维化；真性红细胞增多症；血小板增多，原发性；Janus激酶2；钙网蛋白；基因表达；预后

［中图分类号］R733.3;R394.3

［文献标志码］A

［文章编号］2096-5532（2024）04-0561-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.115

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240829.1446.007;2024-08-3019：15：24

The expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with myeloproliferative neoplasms and their association with prognosis

LI Suxin， WANG Youjun， FENG Liqian， WANG Miao， LI Dongliang， WEN Wen

（Department of Hematology， Shijiazhuang People’s Hospital，Shijiazhuang 050000， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with myeloproliferative neoplasms （MPN） and their association with prognosis.

MethodsA total of 38 patients with MPN who were admitted to Shijia-

zhuang People’s Hospital from July 2018 to July 2022 were enrolled as study group， and 40 volunteers without hematological diseases in our hospital were enrolled as control group. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression levels of the JAK-2 and CALR genes in bone marrow fluid. According to the criteria for prognostic evaluation， the patients in the study group were further divided into low-risk subgroup， intermediate-risk subgroup， and high-risk subgroup. The expression levels of the JAK-2 and CALR genes were compared between the three subgroups， and a Spearman correlation analysis was used to investigate the correlation of the expression levels of the JAK-2 and CALR genes with prognosis.

ResultsCompared with the control group， each subgroup of the MPN group had significant increases in the expression levels of the JAK-2 and CALR genes （F=278.674，615.206;P<0.05）， with the highest expression levels of the two genes in patients with essential thrombocythemia. For the patients with MPN， there were gradual increases in the expression levels of the JAK-2 and CALR genes from the low-risk group to the high-risk group， and the Spearman correlation analysis showed that the expression levels of the JAK-2 and CALR genes were significantly negatively correlated with the prognosis of patients （r=-0.491，-0.503;P<0.01）.

ConclusionThere are abnormal increases in the expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with MPN， and the expression levels of the two genes are negatively correlated with prognosis. Therefore， they can be used to assess the treatment outcome and prognosis of MPN patients in clinical practice.

［Key words］bone marrow neoplasms; primary myelofibrosis; polycythemia vera; thrombocythemia， essential; janus kinase 2; calreticulin; gene expression; prognosis

骨髓增生性肿瘤（MPN）是一组异质性造血系统疾病，包括骨髓纤维化（MF）、真性红细胞增多症（PV）和原发性血小板增多症（ET）[1-3]。其中，PV和ET在临床上还具有较高的合并血栓出血性并发症风险[4]。此外，MPN的发病机制比较复杂，多种基因突变可能影响病人的预后[5]。近年来国内外研究显示，Janus激酶2（JAK-2）和钙网蛋白（CALR）等基因突变可作为MPN发病的“驱动”突变，而相应的基因靶向药物治疗可有效改善病人临床症状和生活质量[6-8]。然而，关于JAK-2和CALR基因表达与MPN病人预后相关性的研究相对较少。因此，本研究采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法检测不同风险以及不同类型MPN病人JAK-2及CALR基因表达，旨在探讨二者表达与病人预后相关性。现将结果报告如下。

1资料与方法

1.1研究对象

按照纳入和排除标准，将2018年7月—2022年7月石家庄市人民医院收治的38例MPN病人纳入研究组，其中男性21例、女性17例，年龄41～65岁，平均（51.33±5.74）岁。按照相关诊断标准将MPN病人分为PV组、ET组和MF组等3个亚组，其中PV组16例、ET组17例、MF组5例。纳入标准：①符合WHO及NCCN制定的MPN诊断标准[9-10]；②了解本研究内容并接受相关检查者；③无认知障碍及精神疾病；④自愿签署知情同意书。排除标准：①合并骨髓增生异常综合征（MDS）、慢性髓系白血病（CML）、凝血-纤溶障碍等其他血液系统疾病；②临床资料不全及不配合相应检查者；③合并严重心、肺、肝、肾功能障碍者。同时，按照年龄±2岁和男女构成比±5%的标准选取本院无血液系统疾病志愿者40例纳入对照组。两组研究对象体质量指数（BMI）、合并基础疾病等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。本研究经医院医学伦理学委员会审核通过。

1.2研究方法

1.2.1JAK-2和CALR基因表达的RT-PCR检测

全部受试者均于髂后上棘行骨髓穿刺术采集骨髓液2 mL，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，置于4 ℃低温保存。按GenBank登录的JAK-2（NM_214113.1）和CALR（NM_004343.3）的序列，应用DNA Star、Primer 5.0软件设计相应的特异性引物。JAK-2和CALR引物及其序列见表2。引物由哈尔滨赛拓生物技术有限公司合成。骨髓液在分离单个核细胞、提取DNA片段后采用RT-PCR检测JAK-2和CALR基因初始拷贝数（即表达量）。所有检测均由本院检验科完成。

1.2.2MPN预后分组方法根据MPN病人的预后评价标准分为低危组、中危组和高危组3个亚组。根据PV、ET和MF包含基因突变特征的国际预后评价系统（MIPSS）[11-12]标准进行预后判断。PV：①低危（0～1分），②中危（2～5分），③高危（≥6分）；ET：①低危（0～1分），②中危（2～3分），③高危（≥4分）；MF（MIPSS-70）[12]：①低危（0～1分），②中危（2～4分），③高危（≥5分）。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。计量资料数据以±s形式表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析；计数资料数据以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman秩相关分析JAK-2和CALR基因表达与MPN预后的相关性。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1各组JAK-2及CALR基因表达比较

相较于对照组，MPN各亚组JAK-2和CALR基因表达均明显升高，差异具有统计学意义（F=278.674、615.206，P<0.001）。此外，采用Bonferroni法比较MPN各亚组JAK-2和CALR基因表达的结果显示，ET组JAK-2和CALR基因表达水平均明显高于PV组及MF组，差异均具有统计学意义（t=5.098～11.877，P<0.05）。提示JAK-2和CALR基因异常表达与MPN发病相关。见表3。

2.2不同预后病人JAK-2及CALR表达比较

依据PV、ET和MF预后评价标准，将MPN病人分为低危组19例、中危组10例和高危组9例。随着MPN病人预后危险度升级，JAK-2及CALR基因表达均逐渐升高，差异具有统计学意义（F=65.294、55.950，P<0.05）。此外，采用Bonferroni法比较MPN不同预后各亚组JAK-2和CALR基因表达的结果显示，高危组JAK-2和CALR基因表达均明显高于低危组及中危组，差异具有统计学意义（t=2.762～6.278，P<0.05）。提示MPN病人JAK-2和CALR基因表达与其预后相关。见表4。

2.3JAK-2和CALR表达与MPN预后相关性

将MPN预后3个亚组中的低危组赋值为0、中危组为1、高危组为2，对病人预后与JAK-2和CALR基因表达进行Spearman相关性分析。结果显示，MPN病人预后与JAK-2和CALR基因表达均呈负相关，差异均具有统计学意义（r=－0.491、－0.503，P<0.05）。提示MPN病人JAK-2和CALR基因表达越高其预后越差。

3讨论

既往国内外的研究表明，多种基因突变参与了MPN疾病的发生与发展，其中以JAKs及CLAR基因最为常见[4，12-14]。JAK作为蛋白络氨酸激酶，共包含JAK-1、JAK-2、JAK-3和JAK-4等4种，其活性调节主要依靠自身磷酸化及与作用蛋白相结合，其中JAK-2突变多会影响骨髓造血细胞的信号通道，以JAK2-V617F基因突变率最高，会引起血脂检查异常，促进血栓形成、继发骨髓纤维化等；CALR基因常由于第9外显子体细胞发生突变，影响细胞糖蛋白合成，导致糖蛋白折叠异常、钙离子动态失衡，进而诱导细胞异常增殖、分化及凋亡[15-19]。当前关于JAK-2及CALR基因与MPN病人预后关系的研究主要集中在有无突变本身，而鲜有研究报道MPN病人JAK-2及CALR基因表达与其预后的关系。因此，本研究旨在探讨MPN病人骨髓液单个核细胞中JAK-2及CALR基因的总体表达及其与预后之间的关系。

本研究结果表明，与对照组相比较，MPN病人JAK-2及CALR基因表达水平显著升高，且不同疾病类型其基因表达不同，其中ET病人JAK-2及CALR基因表达水平相较PV和MF病人更高，提示JAK-2及CALR基因异常表达可能更多地参与了ET的发生与发展，这一结果与外国相关研究结果相类似[20-22]。在机制上，有研究显示MPN病人中性粒细胞和血小板中的JAK-2激酶是与细胞因子和生长因子受体结构域关联的酪氨酸激酶，它与血小板表面P-选择蛋白和多形核白细胞表面活化标记物的表达增加有关[23]。JAK-2表达量增加、功能过度活跃可使它与下游的髓样细胞因子受体EPOR、G-CSFR等结合，诱导受体发生构象改变；激活的JAK-2通过其受体磷酸化后作用于其他信号分子（如信号传导及转录激活蛋白），使后者发生磷酸化，诱导它们的同源或异源二聚化，并随后运输至细胞核，调节其靶基因的转录，从而促进细胞的生长[24-26]。而CALR作为内质网的分子伴侣，与ER中血小板生成素受体细胞外结构域的N-糖基化残基相结合，通过新的C末端及其正电荷加强，导致受体被激活，参与N-糖基化蛋白质和钙储存的质量控制，诱导单核细胞分泌细胞因子，促进细胞的生长[27]。本研究结果还显示，JAK-2及CALR基因表达与MPN病人不同预后亚组均呈显著负相关，即随着病人预后分级由低危组向高危组转变其基因表达随之升高，提示早期针对JAK-2或CALR基因的干预性治疗可能有效控制病人预后向高危转化，这与相关治疗学研究结论相一致[28-29]。

本研究尚存在一定局限性，主要是由于纳入样本单一且量有限，研究数据及临床数据可能存在偏差，对研究结果可靠性存在影响；选取JAK-2和CALR基因表达作为研究项目，两者均与MPN密切相关，但尚未深入探究三者间联系、机制等。因此，尚需进一步扩大样本量及样本来源、深入探究其作用机制，以得到更具有前瞻性、客观性的结果。

综上所述，MPN病人JAK-2和CALR基因表达异常升高，而且其表达与预后呈显著负相关，临床可据此评估MPN病人的疗效及预后。

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（本文编辑于国艺）