As和Ni超标矿山土壤对不同桑树品种生长及根际微生物多样性的影响

关键词：桑树；As；Ni；复合污染；富集；生长；根际土壤微生物；品种筛选

中图分类号：S888；X53 文献标志码：A

矿山资源的开采，形成众多废弃尾矿库[1]。从矿石中提取1 t 金属会产生2～12 t 尾矿[2]，废弃的尾矿中存在大量重金属，这些重金属有时在尾矿中比未开采的土壤高10～20 倍[3-4]。重金属会随地表径流、雨水淋滤等自然作用向周边土壤、地下水迁移，渗入土壤[5]，对周边生态环境造成严重威胁[6]。我国污染耕地约有10⁸ hm²，中、重度污染耕地高达3.33×10⁶ hm²[7]。重金属有富集作用，最终会通过食物链对人体健康产生极大危害[8-9]，摄入过量的重金属会对人体肝脏、肾脏、消化系统和神经系统等造成不可逆的损害[10]。闭库尾矿库重金属土壤生态修复及土地再生利用[11]，不仅避免了随意排放风险，还能增加土地使用面积，为人类活动提供更大空间，极大缓解当前人口、土地和资源矛盾，使尾矿库产生更高的经济和社会价值[12]。

桑树根系旺盛，抗逆性强，生物量大[13-14]，品种资源丰富，不同品种对于重金属的耐受性和积累性存在差异[15]。桑树对土壤复合重金属具有一定的耐受和富集能力[16]，且大多数重金属主要富集于根部[17-18]，而种桑养蚕模式可消除土壤中重金属通过食物链进入人体造成累积毒害危险[19]，同时可获得较好的经济和社会效益[20]，是矿山污染土地治理并实现作物种植结构调整的一种理想树种[21]。桑树通常在其地上和地下部分与各种微生物相互作用[22]，在生物圈中，桑树与不同微生物的相互作用使它们能够获得广泛的共生优势[23]，从而增强桑树的生长发育以及对重金属的胁迫耐受性[24]。桑树根部会通过激素代谢、胁迫响应、次生代谢以及信号传导、蛋白质代谢、转运和细胞壁代谢参与重金属胁迫响应[25]，改变根际微环境，影响根部土壤微生物群落结构、功能和多样性。根际微生物可直接影响重金属形态的迁移和转化，因此，桑树对重金属的耐性和转移具有重要作用[26]。

近年来因海南某矿区部分开采结束，产生废弃尾矿库，As 和Ni 超标。不同桑树品种对As和Ni 复合污染的积累特性和土壤微生物的相关研究尚无报道，本研究比较3 个不同品种桑树对矿区As 和Ni 复合污染土壤种植60 d 后不同部位对As 和Ni 的富集差异，同时采用宏基因组分析根际微生物组的差异，以明确不同桑树品种对As和Ni 复合污染土壤的适应能力以及与桑树根际微生物多样性间的关系，为筛选适宜矿区生长且耐As 和Ni 复合污染的桑树品种，以及为可促进桑树在As 和Ni 复合污染矿山土壤生长的菌株筛选和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1土壤采集

土样采集地为海南省某铁矿尾矿库，尾矿库土壤总体营养物质含量较低，无植被覆盖，尾矿库已闭库。尾矿库土壤营养参数：含水量为1.98%，pH 为7.80，总氮含量为0.01%，全磷含量为377.75 mg/kg，有效磷含量为0.85 mg/kg，有机碳含量为7.48 g/kg，微生物碳含量为139.69 mg/kg，微生物氮含量为49.57 mg/kg，溶解性有机碳含量为67.14 mg/kg。重金属含量检测为As 和Ni 超标，其中As 含量为88.19 mg/kg，达重度污染，Ni 含量为393.39 mg/kg，为中度污染。

于2022 年4 月9 日每个点按100 m×200 m 布设土壤采样点位，共布设3 个土壤样品采集点位，每个采样点位采10 个分样点的土样并进行混合，采样深度为0～20 cm，去除小石块和其他非土壤成分。所取每个点位混合土壤均按照四分法各取1 kg 进行pH、重金属含量及主要营养元素测定。之后在矿区土壤中补充主要营养元素（N、P、K）至与周边正常土壤一致，装入花盆中种植桑苗，种植后不再施肥。

1.2 桑苗种植及取样

供试3 个桑树品种分别为Y120、G62 和G12，均为同水平种植的一年生种子苗，属于热带亚热带栽培品种，产量高，抗逆性强。于2022 年4 月10 日种植，随机选取长势一致的3 个品种各30株，并统一修剪至15 cm 高度，单株种植于装有10 kg 尾矿库土壤的花盆（直径33 cm，高22 cm）。每个花盆之间的间距约为10 cm，每天早上8：00浇水，保持土壤相对湿度为60%～70%。以正常土壤种植为对照。60 d 后对植株和土壤分别进行采样。

于2022 年6 月11 日对3 个桑树品种随机各选取9 株，并平均分成3 组，每组3 株，将每组土壤和桑树分离，每组土壤混匀后取1000 g，研磨后过100 目筛，用于重金属含量测定；每组桑树分别用灭菌毛笔刷取根际土壤，土壤混匀后用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于宏基因组测序，分析不同桑树品种根际土壤微生物的种属变化；每组桑树洗去根部附着土壤，用超纯水冲洗，吸干水分后称量植株鲜质量，并将根、茎和叶分开，70 ℃烘干至恒重，研磨并过100 目筛，用于重金属含量测定。

1.3 土壤pH 及重金属含量测定

取（10.0±0.1）g 土壤加入25 mL 水，密封、搅拌5 min，静置2 h 后，参照NY/T 1377—2007 测定土壤pH；参照HJ 680—2013 采用原子荧光法测定土壤As 含量；采用ICP-MS 法测定土壤Cd、Cr 和Pb 含量；参照HJ 491—2019采用火焰原子吸收分光光度法测定土壤Ni 含量。

1.4 桑树组织内重金属含量测定

称取植物样品0.50 g，加入5 mL 68%硝酸（HNO）浸泡过夜。再加入10 mL HNO、5 mLHClO 加热消煮蒸发至透明，继续蒸发至溶液冒浓厚白烟，冷却，用1% HNO 冲洗过滤于25 mL比色管中，用蒸馏水定容至25 mL，采用原子分光光度计测定桑树各部位重金属含量。

1.5 桑树根际土壤微生物分析

采用DNA 提取试剂盒提取所有样品的总DNA。完成基因组DNA 提取后，使用琼脂糖凝胶电泳（AGE）分析DNA 的纯度和完整性，使用NanoDrop 检测DNA 的纯度（OD/OD），使用Qubit 对DNA 浓度进行精确定量以完成对提取DNA 的检测。

检测合格的DNA 样品用超声波破碎仪随机打断成长度为所需片段，然后进行末端修复，3ʹ端加A，连接测序接头，进行PCR 扩增与纯化后，构建测序文库。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至1 ng/μL，随后使用Agilent 2100 对文库的insert size 进行检测，insertsize 符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度>2 nmol/L），以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling 后进行PE125/150/250，使用Illumina HiSeq 2500 进行测序。

测序结束后对结果进行宏基因组信息分析，利用基因组比对软件BWA，将过滤后的cleanreads 与宿主参考序列进行比对，将比对到宿主的序列去除后，剩余的clean reads 与细菌（或XT1ilI/ZyCE8elxefAtosg==病毒）参考序列进行比对。采用Illumina 二代测序的短序列拼接软件SOAPdenovo，Velvet 和SPAdes 短序列组装软件均基于de-Bruijn 算法进行构图，对测序序列进行简化、纠错；reads 取K-mer 后基于overlap 形成contig；contig 基于reads 的双末端关系组成scaffold；最后scaffold 延伸得到组装序列。采用MetaGeneMark 软件对组装序列进行基因预测，将预测出来的基因与Swiss-Prot 数据库中的序列进行比对，得到注释信息。

计算不同取样深度下Observed species 、Chao1、Simpson 和Shannon Index 4 种Alpha 多样性指标值，绘制实际观测到的物种稀释曲线图、推测出物种指数稀释曲线图、物种均一性稀释曲线图、综合稀释曲线图，分析样品间物种的类别丰富度以及物种数目的均匀度。对样品进行Beta多样性分析，使用Unifrac 算法计算不同样品之间的Unifrac 距离，以Unifrac 距离绘制Heatmap，分析不同样品之间微生物群落结构的相似性或差异性。绘制不同桑树品种根际土壤微生物属水平上的物种丰度热图，分析不同桑树品种微生物群落菌属组成的相似性和差异性。

1.6 数据处理

重金属单因子污染指数（P）=土壤中污染元素的实测含量/土壤污染元素的评价标准。P≤1表示无污染，1.03.0 表示重度污染。

转运系数（TF）=植物地上部重金属元素含量/植物地下部重金属元素含量。

富集系数（BCF）=植物体内重金属元素含量/土壤中对应重金属元素含量。

采用Microsoft Excel 2013软件计算不同桑树品种根际土壤重金属污染指数、不同桑树品种对重金属的富集系数以及在桑树中的迁移系数等。采用IBM SPSS Statistic 25软件邓肯氏新复极差检验法进行差异显著分析。

2 结果与分析

2.1 As 和Ni超标矿山土壤对不同桑树品种生长的影响

种植60 d 后，与正常土壤种植（CK）相比，3 个桑树品种的生长均受到不同程度的影响，其中，G62 的影响程度最小，而且长势最好，其次为Y120，G12 影响程度最大，长势最弱。3 个桑树品种的株高均显著下降，但是叶片数与株高不同，种植在尾矿库土壤后，G62 的叶片数量增加，而G12 和Y120 的叶片数却显著减少（图1，图2）。表明桑树品种G62 的耐胁迫能力最强，能在尾矿库土壤中较好生长。

2.2 种植不同桑树品种后土壤As 和Ni含量的变化

3个桑树品种种植60 d 后，土壤pH 为7.6，As 和Ni 含量均较种植前下降。其中，种植G62后土壤As 含量从88.19 mg/kg 降至69.25 mg/kg，降低了21.47%，土壤污染指数从种植前的3.53降至2.77，从重度污染降为中度污染；种植G12后土壤As 含量降至75.08 mg/kg，降低了14.86%，土壤污染指数降至3.00，但仍为重度污染；种植Y120 后土壤As 含量降至80.79 mg/kg，降低了8.39%，土壤污染指数降至3.23，也仍为重度污染。种植G62 后土壤Ni 含量从393.39 mg/kg 降至302.72 mg/kg，降低了23.05%，土壤污染指数从种植前的2.07 降至1.59，从中度污染降为轻度污染；种植G12 后土壤Ni 含量降至246.93 mg/kg，降低了37.23%，土壤污染指数降至1.30，从中度污染降为轻度污染；种植Y120 后土壤Ni 含量降为307.32 mg/kg，降低了21.88%，土壤污染指数降为1.62，从中度污染降为轻度污染（表1）。

2.3 不同桑树品种对As 和Ni的富集转移能力

种植60 d 后，3 个桑树品种As 和Ni 含量及对As 和Ni 的转移系数及富集系数见表2。种植60 d 后，3 个桑树品种植株内的As 和Ni 含量存在一定差异，其中，Y120 植株内的As 含量最高，为10.59 mg/kg，其次为G62（6.25 mg/kg），最低为G12（5.68 g/kg）。G62 的Ni 含量最高，为78.38 mg/kg，其次为Y120（71.7 mg/kg），G12最低（70.21 mg/kg）。

3个桑树品种地上部分对As 和Ni 的转运系数均大于1（表2），但对As 的转移能力均低于Ni，对Ni 的转移系数最高可达3.16（G12），最低为1.19（Y120），G62 居中，为1.74。3 个品种对As 和Ni 的富集系数均较低，在As 和Ni 重度或中度污染环境中可生长，可能存在避性而使其能够在较高质量浓度的As 和Ni 复合污染土壤中生长，因此可作为As 和Ni 复合污染矿山土壤修复的先锋植物。

2.4 不同桑树品种根际土壤微生物Alpha多样性和Beta多样性分析

Observed species 和Chao1 分别反映了G12、G62 和Y120 根际土壤样本中实际检测到的微生物物种数量和外推微生物物种数量，可直观比较不同桑树品种根际微生物群落的物种丰富度。随着取样加深，曲线均趋向平坦，G12、G62 和Y120实际检测到的物种和外推物种丰富度相近（图3A，图3B）。Simpson index 可衡量每个样本中物种分布的均匀程度，Shannon index 是综合考虑样本中物种丰富度与均匀度的一个多样性指数。由图3C、图3D 可知，3 个桑树品种种植于尾矿库土壤后，根际土壤微生物群落不仅在物种分布均匀度上相似，而且在物种丰富度及其相对丰度的组合方面也无显著差异。

Unifrac 分析基于物种组成和物种丰度数据，通过计算每个群落中物种的相对丰度来评估群落的相似性和差异性。Unifrac 分析可视化结果能够直观展示样本间微生物组成的相似性和差异性。每个小方格的颜色代表2 个样本间的Unifrac 值，颜色越深表示差异越大，颜色越浅则表示相似度越高。不同桑树品种种植于尾矿库土壤60 d 后，G12 和G62 之间的颜色较浅，表明它们之间相似度较高，微生物群落组成具有较大相似性；Y120 与G12、G62 之间的颜色较深，表明它们之间相似度较低，微生物群落组成具有较大的差异（图4）。

2.5 不同桑树品种根际土壤微生物多样性分析

种植于As 和Ni 超标矿山土壤60 d 后，不同桑树品种根际土壤微生物属和种水平丰度均存在显著差异，其中G12 和G62 的物种丰富度水平相近，分别检测到62 个和61个类群，Y120 仅检测到50 个类群（图5）。

不同桑树品种根际土壤微生物属组成分析表明，G12和G62的根际土壤微生物属组成较为相似，而与Y120 组成具有显著差异（图6）。Nocardioides、Thiomonas 和Rhizobium 3 个属在G62 根际土壤中丰富度较高，分别达5.22、3.15和2.43，显著高于G12（1.45、0.93 和1.28）和Y120（0.48、0.15 和1.16），结合G62 根际土壤As 的污染指数下降较多，而生长情况优于G12和Y120 的现象，说明这些属可能更多地参与桑树根际对As 的阻隔吸收或解毒，降低了其对桑树生长的影响。Actinoplanes、Rhodopseudomonas、Pseudoxanthomonas 、Variovorax 、Achromobacte和Bradyrhizobium 6 个属在Y120 根际土壤中的丰富度较高，分别为7.66、5.34、5.05、3.65、2.27和1.23，显著高于G12（2.69、3.63、3.48、2.62、1.10 和0.65）和G62（1.45、3.76、0.65、2.32、0.33和0.55），结合Y120 对As 的转运和富集系数均高于G62 和G12，这些属可能与桑树对As 的转运和富集有关。相比其他2 个品种，G12 生长最差，其根际微生物中Sphaerobacter 和Brevundimonas 2 个属的丰富度显著高于G62 和Y120，Sphingopyxis和Sphingobium 2 个属显著高于G62。

不同桑树品种根际土壤微生物种的组成分析表明（图7），Sphingopyxis sp.、Rhodopseudomonaspalustris 和Variovorax sp.在3个桑树品种根际土壤中的丰富度均超过2.00，其中Sphingopyxis sp.在G12 中丰富度最高，达6.01，而该品种植株内转移和富集的As 和Ni 均最低，说明Sphingopyxissp.可能与桑树对As和Ni 复合污染的解毒有关。Sphingobium sp.、Actinoplanes sp.和Thiomonas sp.均超过1.00。Sphingopyxis sp.、Rhodopseudomonas palustris 、Variovorax sp. 、Sphingobium sp. 和Actinoplanes sp. 5 种菌在Y120 和G12 两个品种根际土壤中的丰富度均显著高于G62，可能与其更多参与桑树对As 和Ni 复合污染的解毒有关；而Thiomonas sp.在G62 中可能与其更多参与桑树对As 的解毒有关。

3 讨论

目前，关于重金属污染土壤对桑树影响的研究主要集中在单一重金属污染上，特别是镉污染[27-29]，但是在实际的重金属污染土壤中，土壤污染多以多种重金属污染共存的状态存在[30-31]，因此，研究复合重金属污染土壤对桑树生长的影响具有重要的理论和实践意义。本研究开展As和Ni 复合污染矿山土壤中不同桑树品种的生长特性和耐受性及其与根际土壤微生物多样性的关系研究，为利用适宜当地气候环境的桑树品种修复和再利用矿山土壤提供有效途径。

研究发现，在As 和Ni 重、中度污染矿区土壤中种植60d 后，3个桑树品种地上部分的生长受到不同程度的抑制。As 可以通过磷吸收系统和质膜进入植物，与磷竞争结合位点[32-34]，还可以与生物大分子结合，导致结构变化和功能破坏，影响酶活性和细胞功能，并诱导氧化应激和其他对植物生长产生负面影响的生理反应[35-36]。然而，郑鹏飞等[37]的研究中，As 和Cd 的污染指数远高于本研究的矿山土壤，而供试桑树品种湘7920生长完好，无胁迫症状。可能与不同桑树品种对As的耐受程度存在较大差异有关，也可能是As 和Ni 复合污染对桑树的生长发育影响较As 和Cd复合污染更大，后续有待进一步研究证实。重金属在植物根际细胞壁中的固定或螯合是植物生长的一个重要解毒过程[38]，在本研究中，观察到与叶和茎相比，3 个桑树品种在根部表现出更高的As 富集能力，能够积累近一半的总As 含量，表明桑树的根部可能具有固定As 的能力，从而降低As 对地上部分的毒性，而本研究3 个桑树品种对As 的富集和转运系数均较低，但对Ni 的富集和转运系数却均较高，同时也发现，不同桑树品种的不同部位对Ni 的富集能力与As 不同，尤其是根部，3 个品种差异较大，G12 地上部分转移Ni的能力最强，显著强于G62 和Y120，其生长所受抑制也最强，表现出较少的分枝和叶片，这可能是由于Ni 胁迫引起的。研究表明，土壤中Ni含量的增加会抑制植物发芽、叶片斑点和黄化、减少根和芽的生长等，同时也会影响植物的Fe吸收，最终导致作物产量的损失[39]。另一方面，G62 中Ni 转移到叶片的能力较强，可能与其生理机制的发展，如将重金属储存在液泡和叶脉中的主动转运，从而降低它们的毒性并确保植物的正常生长有关[40]。研究发现桑树对重金属的富集能力Cd>Ni>Cr>As[41]，本研究的3 个桑树品种对Ni 的富集能力强于As，且可将Ni 的污染指数从中度污染降为轻度，其中G12 使土壤Ni 含量降了37.23%，可进一步研究利用G12 作为Ni 修复的潜力和机制。

本研究中G62 在As 和Ni 污染矿山土壤中生长较好，分枝和叶片数量增多，可能与其根际土壤中的Thiomonas、Rhizobium 和Nocardioides 丰度较高有关。土壤微生物的大量繁殖会进一步提高土壤的生物肥力和物理肥力，从而提高土壤中N、P、K等矿质营养元素的利用率，形成良性循环，有利于植物的生长并可增强植株抗逆性[42]。Thiomonas可以利用As 作为能源自养，提高植物的固碳能，还可以使用As（III）作为唯一的能量来源进行自养生长，诱导其固碳特异性酶的表达，从而提高其固碳能[43]，G62根际土壤中的Thiomonas sp.丰度较高，可能促进了G62 对碳的固定能力，从而部分补偿了土壤中碳的不足，使G62可较好生长，发出更多的分枝，长出更多的叶片。Rhizobium 对As 表现出高度的耐受性，并且可提高宿主根瘤数，增加宿主植株的地上部分氮含量，为植物提供可利用的氮[44-45]。G62根际土壤中的Rhizobium etli 丰度较高，可能为其他根际微生物和桑树植株提供生物可利用的氮，在As 和Ni 超标土壤修复中发挥积极作用。Nocardioides 在多种As 污染的根际土壤中富集，与As 含量呈正相关[46]。本研究中Nocardioides sp.在生长良好的G62 根际土壤中丰富度较高，可能该品种在As 的抗性和转化中发挥着重要作用。Rhodopseudomonas 和Bradyrhizobium均具有氧化As 的能力，能把高毒性的三价As 氧化为低毒的五价As ， 不利于植物吸收， 且Rhodopseudomonas 有多种解毒机制，可有效去除环境中As 的污染[47-48]。Y120 根际土壤中的Rhodopseudomonas palustris 和Bradyrhizobiumjaponicum 在3 个桑树品种根际土壤中的丰度均较高，可能主要参与桑树对As 的解毒过程。

桑树作为我国广泛分布的多年生木本植物，对土壤和环境的适应性强，生长速度快，根系发达，生物量大，耐剪伐，对重金属具有一定的富集和耐受能力，在修复土壤重金属污染方面的应用价值日益突出[47-48]。本研究中，在As 和Ni 复合污染的尾矿库土壤中种植桑树60 d 后，G62 的分枝数和叶片数增加，生长较好，且能使根际土壤的As 和Ni 含量分别降低21.47%和23.05%，污染指数均下降，结合其根际Rhodopseudomonaspalustris、Bradyrhizobium japonicum、Thiomonassp.、Rhizobium etli 和Nocardioides sp.丰度较高的现象，推荐可将G62 作为铁矿尾矿库修复和再利用的优良桑树品种，并通过进一步验证微生物的促生作用，选择添加合适的菌株，以更好发挥G62对As 和Ni 复合污染土壤中的修复和利用价值，不仅可通过根部吸收转运和固定As 和Ni，桑叶用于养蚕，部分As 和Ni 又可转移至蚕沙被无害化处理，实现尾矿生态修复和蚕桑高效安全利用模式。