奇楠沉香精油挥发性成分分析及其体外抗炎活性研究

关键词：奇楠；精油；抗炎；RAW264.7细胞；信号通路

中图分类号：R285.5 文献标志码：A

沉香是瑞香科沉香属（Aquilaria）或拟沉香属（Gyrinops）植物含有树脂的芯材[1]，主要分布于印度、缅甸、老挝、越南、中国、柬埔寨、泰国等亚洲国家[2]。在我国，主要分布在广东、海南、广西、福建和台湾等地区。沉香作为一种热带特色作物，具有抗氧化、镇痛抗炎、降糖等良好功效[3]。近年来，随着沉香的市场需求增加，香农们从白木香天然林内选育出一类具有优良特性的品系，该品系具有结香早、结香快、结香质量高等优点，俗称易结沉香，即为奇楠沉香。奇楠又称伽南、伽楠、伽蓝、棋楠等，英文名有Kanankoh、Kyara、Chi-Nan、Qi-Nan 等[4]，其价格是普通沉香的上百甚至上千倍。随着奇楠人工培育技术逐渐成熟，奇楠沉香已初步形成产业[5]。奇楠沉香与普通沉香的主要区别在于其香气更加持久绵长、质地较软，油脂含量丰富，提取物得率及色酮含量比普通沉香更高[6]。张琳等[7]从奇楠沉香中分离的6-羟基-2-[2-（3-羟基-4-甲氧基苯）乙基]色酮能抑制由LPS 诱导RAW264.7 细胞产生NO 的作用，初步说明奇楠沉香具有抗炎活性。

奇楠沉香精油（Qi-Nan essential oil， QEO）作为奇楠沉香最重要的活性成分，具有多种生物活性，但目前针对QEO 的研究主要集中在成分分析鉴定和简单活性评价。有研究团队对从水蒸气蒸馏法提取的QEO 进行成分分析，发现其倍半萜类化合物含量差异很大， 分别为76.31%[8] 和90.28%[9]，说明QEO 成分可能与品种、品质和种植地等因素有关。余珍[10]对3 种不同品种的QEO进行研究，发现QEO 的主要成分均为倍半萜类、2-（2-苯乙基）色酮类和简单芳香族化合物，且具有抑制NO 产生的效果。此外，陈细钦等[11]对比了分别用水蒸气蒸馏和超临界萃取的普通沉香精油和QEO，结果表明超临界萃取的精油抗氧化活性均强于水蒸气蒸馏精油，并且QEO 对于LPS 诱导的RAW264.7 细胞存活率的抑制作用最佳，这可能是奇楠沉香中的色酮类成分含量远高于普通沉香。在现有关于QEO 的研究中，已初步证实其具有抗炎活性，但鲜有对超临界CO2 萃取法提取QEO的抗炎活性进行系统研究的报道。

本研究拟以超临界CO萃取法提取的QEO作为研究对象，通过GC-MS 分析QEO挥发性成分，并对QEO的抗氧化活性进行评价。然后，采用生物信息学手段对QEO与炎症相关的靶点、主要活性成分及相关的信号通路进行预测。最后利用LPS 诱导RAW264.7细胞建立炎症模型验证QEO的抗炎活性，以期为奇楠沉香产业的深入开发和高效利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 奇楠沉香木种植于广东省茂名市茂南区山阁镇黄杰村委会塘尾村（110°57′9.594″E， 21°42′47.5272″N）。小鼠巨噬细胞（RAW264.7）购自中国科学院细胞库。DMEM 培养基、PBS 缓冲液、双抗（ThermoFisherScientific Gibco ）、脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）购自Sigma 公司；胎牛血清（FBS）购自Serana 公司；CCK-8 试剂盒、一氧化氮（NO）检测试剂盒、活性氧（ROS）试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；P65、P-P65、P-IκB-α、IκB-α、β-Actin、二抗购自Santa Cruz 公司。

1.1.2 仪器与设备 气相色谱质谱连用仪，日本岛津公司；二氧化碳恒温培养箱，美国ThermoScientific 公司；酶标仪，美国BIO-TEX 公司；倒置荧光显微镜，日本Olympus 公司；电泳系统、电转系统，美国Bio-Rad 公司；凝胶成像系统，中国Tanon 公司。

1.2 方法

1.2.1 精油提取和纯化 奇楠沉香木粉碎后过80 目筛，准确称取100 g 放入萃取罐。设置萃取条件为30 MPa，45 ℃，二氧化碳流量为20 L/h，萃取4 h。然后将萃取物放入专用的分子蒸馏中进行分离纯化，并收集馏出物，即获得QEO。

1.2.2 成分分析 将QEO 溶解于正己烷中，使用0.22 μm 尼龙膜过滤，备用。采用HP-5 弹性石英毛细管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），进样量为1 μL。分别设置流速（1.0 mL/min）、分流比（30∶1）、进样温度（250 ℃）和传输线温度（280 ℃）。起始温度120 ℃，3 min，然后以3 ℃/min 升至180 ℃，再以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。EI 电离70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度150 ℃，扫描方式为全扫描，扫描范围为35～600 m/z。

1.2.3 DPPH 自由基清除能力 将QEO 溶液与DPPH 的甲醇溶液混合，常温避光反应30 min，测定517 nm 处的吸光值，记为A。等量的无水乙醇和DPPH 的甲醇溶液混合作为空白反应体系，并测得吸光值，记为A。以维生素C（Vc）作为阳性对照。DPPH 的清除能力按以下公式计算：

1.2.4 总抗氧化能力 将FRAP 工作液与QEO充分混匀，室温避光反应10 min，蒸馏水调零，于593 nm 处测其吸光值，VC 作为阳性对照。以FeSO 溶液作为标准品绘制标准曲线，总抗氧化能力值以Fe²⁺含量表示，单位为μmol/mL。

1.2.5 生物信息学分析 在PubChem 网站检索QEO 的成分Smlies，然后将Smlies 导入SwissTarget Prediction 数据库，使用Uniprot 数据库校正靶点。以inflammation 为关键词，在GeneCards、Disgenet、OMIM 数据库检索，结果采用Venny2.1.0 构建韦恩图，获取QEO 与炎症的交集靶点。将交集靶点导入String 数据库，保存蛋白交互信息文件。使用Cytoscape 3.9.1 软件构建药物成分靶点网络图和蛋白质互作网络图（protein-proteininteraction， PPI）。通过David 数据库对交集靶点进行KEGG 和GO 富集分析，并使用微生信平台对结果进行可视化。

1.2.6 细胞培养 RAW264.7 细胞采用DMEM完全培养基（10% FBS 和1%双抗）于37 ℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。

1.2.7 细胞活力测定 试验组分别加入不同浓度的QEO（1、10、20、50 μg/mL），空白组加入等体积的DMEM 培养基，于细胞培养箱中孵育24 h。使用CCK-8 法检测QEO 对细胞毒性的影响：弃除培养液，加入CCK-8 试剂，培养箱中孵育30 min，采用酶标仪在450 nm 波长下测定每孔吸光值，计算细胞的活力。

1.2.8 NO 含量测定 试验组加入不同浓度的QEO（1、10、20 μg/mL），培养2 h，无QEO 为空白组（COG）；然后加入终浓度为1 μg/mL 的LPS 刺激24 h，COG 中加入LPS 处理为模型组（MOG）。取上清液并依次加入NO 含量检测试剂，测定540 nm 处的吸光值，根据NO 标准曲线计算浓度。

1.2.9 NO 荧光强度测定 如1.2.8 处理细胞后，吸取并弃除培养基，加入浓度为5 μmol/L 的DAFFMDA，37 ℃孵育30 min 后，用PBS清洗3次。利用倒置荧光显微镜拍照并记录细胞荧光强度。

1.2.10 活性氧（ROS）含量测定 如1.2.8 处理细胞后， 吸取并弃除培养基。加入浓度为10 μmol/L 的DCFH-DA 工作液，37 ℃避光孵育30 min 后，用PBS 清洗3 次。利用倒置荧光显微镜拍照并记录细胞荧光强度。

1.2.11 ELISA 检测炎症因子含量 细胞处理同1.2.8。使用ELISA 试剂盒对培养基中炎症因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）含量进行检测。

1.2.12 Western blot 检测蛋白表达水平 细胞处理同1.2.8。使用细胞刮收集细胞后加入裂解液在冰上进行快速裂解，然后进行4 ℃、13000g高速离心，吸取上清备用。调整蛋白浓度后进行变性即获得蛋白样品。然后通过电泳和转膜将目标蛋白转移至NC膜上，并采用常温封闭（1 h）、一抗（4 ℃过夜）和二抗（常温，1 h）孵育得到目标蛋白条带。最后采用化学发光系统进行图像采集。

1.3数据处理

每次试验重复3次以上，各组数据以平均值±标准差的形式表示，使用Origin 2021和Prism 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 奇楠沉香精油挥发性成分分析

采用GC-MS方法对QEO挥发性成分进行分析，得到总离子流色谱图（图1）。结果如表1 所示，从QEO 中鉴定出37种成分，其主要的化合物类别为色酮类（50.08%）、倍半萜类（26.28%）、芳香族化合物（12.59%）（图2）。通过峰面积归一化法测定相对百分含量前5 位从高到低依次为2-（2-苯乙基）-色酮（50.08%）、石竹素（8.45%）、绿叶烷（6.46%）、榄香醇（3.88%）、2-烯丙基-6-甲基苯酚（2.78%）。其中，相对含量最高的成分为2-（2-苯乙基）-色酮，说明其为QEO 的主要挥发性成分。此外，研究发现从白木香中分离出的2-（2-苯乙基）-色酮[12]及其衍生物[13]能够显著抑制LPS 诱导RAW264.7 细胞NO 的过量产生，表明其具有良好的抗炎活性。

2.2 奇楠沉香精油抗氧化活性的测定

本研究测试1～50 mg/mL 浓度范围内QEO 清除DPPH 自由基的能力。从图3A 可以看出QEO对DPPH 自由基清除能力随着QEO浓度增大逐渐增强，在浓度为1 mg/mL 时，QEO 清除率为51.98%。此外，可明显看出QEO 清除DPPH 自由基的能力在20 mg/mL 时达到最大值，说明QEO在1～50 mg/mL 范围具有一定的清除DPPH 自由基的能力。如图3B 所示，QEO 总抗氧化能力的结果以每毫升含有的Fe²⁺含量表示。FeSO 标准曲线回归方程为y=4.8772x+0.001，R²=0.9998，说明线性良好，可用于抗氧化能力的计算。在1～10 mg/mL浓度范围内，随着QEO 浓度增大，Fe²⁺含量逐渐增加，表示QEO 的还原力也逐渐增强，说明QEO的总抗氧化能力与浓度存在一定的量效关系。

2.3奇楠沉香精油生物信息学分析

通过数据库筛选得到QEO活性成分靶点有594 个，炎症靶点15394个，QEO 与炎症的交集靶点共有553个（图4）。图5A 为QEO 活性成分交集靶点网络图，根据degree值的大小，排名前15 的关键活性成分为紫苏醇、榄香醇、α-古巴烯-11-醇、1，3-双-（2-环丙基，2-甲基环丙基）-丁-2-烯-1-酮、异香橙烯环氧化物、石竹素、1b，5，5，6a-四甲基-八氢-1-氧杂环丙烷并[a]茚-6-酮、异香叶醇、顺式-（Z）-α-双没药烯环氧化物、缬草提取物、α-甜没药醇、氧杂环十四烷-4，11-二炔、除虫菊酯、2-（2-苯乙基）色酮、2-甲基-3-（苯磺酰基）甲基-2-环戊烯-1-酮。从图5A 中可看出QEO发挥抗炎活性时具有多成分、多靶点的作用特点。如图5B所示，QEO 发挥抗炎活性的关键靶点主要包括SRC、MAPK1、AKT、HSP90AA1、PI3K3CA 等。在David 数据库中对QEO作用炎症的553 个交集靶蛋白进行GO 注释分析和KEGG 信号通路富集分析。如图6A 所示，QEO发挥抗炎活性可能与细胞质膜上的靶点、以及蛋白磷酸化和ATP 结合等作用环节有关。KEGG富集分析得到186 条信号通路，以P 值作为富集程度显著性标准，取排名前20 条通路建立气泡图。如图6B 所示，QEO作用炎症反应较显著的通路主要有NF-κB、MAPK和PI3K-Akt 等炎症信号通路，以上结果说明QEO可能是通过上述信号通路发挥抗炎作用。因此，本研究在生物信息学的基础上重点考察QEO对NF-κB信号通路的调控作用。

2.4 奇楠沉香精油对RAW264.7细胞活力的影响

如图7 所示，将1、10、20、50 μg/mL QEO作用于RAW264.7 细胞24 h 后对细胞存活率进行检测。与COG 相比，在QEO 浓度为50 μg/mL时，细胞存活率为43.24%，显示出极显著毒性。当QEO 浓度在1～20 μg/mL 浓度范围内，细胞活力与COG 相比均无明显差异。因此，选取1、10、20 μg/mL 浓度的QEO 进行后续试验。

2.5 奇楠沉香精油对RAW264.7细胞NO含量的影响

根据说明书，以NaNO作为标准溶液绘制NO 标准曲线，回归方程为y=0.0082x‒0.007，R²=0.9996，说明在此浓度范围内线性良好，可用于NO含量的计算。如图8 所示，LPS 使对照组中的NO含量显著升高到COG的5倍，说明LPS能显著刺激RAW264.7 细胞产生炎症反应，而1、10、20 μg/mL QEO处理组能够极显著地抑制NO的过量产生（P<0.001），且呈浓度依赖性。

2.6奇楠沉香精油对RAW264.7细胞NO荧光强度的影响

如图9 所示，与空白组相比，LPS导致细胞中荧光强度显著增强（P<0.001），表示LPS刺激使得细胞中的NO含量显著增加。而加入QEO的处理组，随着QEO浓度的增加，其荧光强度逐渐减弱。说明LPS能够刺激RAW264.7细胞产生明显的炎症反应，而QEO处理使得这种炎症反应有所缓解。

2.7奇楠沉香精油对RAW264.7细胞ROS水平的影响

在LPS诱导的炎症过程中，细胞可能会受到刺激产生过量的ROS，导致ROS 和抗氧化剂之间的失衡，诱发免疫功能紊乱[14]。细胞中ROS 的荧光强度如图10 所示，和COG 相比，LPS 刺激RAW264.7 细胞产生了大量的ROS。但经过1、10、20 μg/mL QEO 处理后，细胞内ROS 的含量呈浓度依赖性极显著降低（P<0.001），其中20 μg/mLQEO处理组的荧光水平与COG 基本一致。

2.8 奇楠沉香精油对RAW264.7细胞炎症因子的影响

RAW264.7细胞被激活时，炎症因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）会过度释放，这将使炎症反应进一步加重甚至失控，最终导致机体炎性病理损伤[15]。如图11 所示，与COG相比，MOG 中的TNF-α、IL-6 和IL-1β 经过LPS 刺激后，其含量均极显著增加（P<0.001），而在1、10、20 μg/mL的QEO 预处理的试验组，TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量随着QEO浓度的增加呈极显著降低（P<0.001），说明QEO 能够剂量依赖性地抑制LPS 诱导RAW264.7 细胞炎症因子的过度产生。结果表明QEO 可以显著抑制由LPS 刺激导致的RAW264.7细胞的炎症反应。

2.9 奇楠沉香精油对RAW264.7细胞NF-κB信号通路的影响

为了进一步研究QEO发挥抗炎活性的作用机制，通过蛋白免疫印迹实验对NF-κB 信号通路进行研究。如图12 所示，当RAW264.7 细胞被LPS刺激后，P-P65和P-IκB-α蛋白的表达极显著增加（P<0.001）。然而，经过QEO的预处理能极显著下调细胞中P-P65 和P-IκB-α蛋白的表达（P<0.001），并且随着QEO 的增加，其磷酸化蛋白的表达水平逐渐下降，说明QEO 对于P65 和IκB-α 蛋白磷酸化的抑制具有显著效果，能够抑制NF-κB 通路的激活，进而发挥良好的抗炎活性作用。

3 讨论

目前有关沉香的研究不断加深，沉香功效也得到了更多发掘和利用。QEO作为奇楠沉香最重要的活性成分，开发价值巨大。本研究从QEO中共鉴定出37 种成分，其主要的化合物类别为色酮类、倍半萜类和芳香族化合物， 含量分别为50.08%、26.28%和12.59%。大量研究发现从沉香中分离出的色酮类[16]和倍半萜类[17]化合物具有较好的抗炎作用，能够减轻炎症损伤。此外，YANG 等[18]对野生和人工栽培的奇楠沉香进行成分比较，发现其中的色酮类含量明显不同，分别为72.43%和95.61%，本研究结果与此也有较大差异，这可能与奇楠沉香的种植地、结香方式不同有关。通过体外抗氧化活性试验发现，QEO在1～50 mg/mL浓度范围的DPPH自由基清除率和总抗氧化能力随着浓度的增加而上升，结果表明QEO 具有较好的抗氧化活性。研究发现大多数的抗氧化剂的有效成分均具有抗炎特性[19]，综合以上分析表明QEO 在抗炎方面具有巨大的潜力。

本研究基于上述结果，采用生物信息学方法预测分析QEO的抗炎作用机制。筛选出QEO 与炎症交集靶点553个，通过拓扑分析得到的成分-靶点网络图可以看出QEO中的核心成分类型为倍半萜类化合物和2-（2-苯乙基）色酮，这些结果提示QEO具有多组分、多靶点的作用特点。GO 和KEGG 富集分析结果表明QEO主要通过细胞质膜、细胞质、树突等细胞组分参与基因表达的调控，主要涉及蛋白磷酸化、炎症反应、细胞增殖的正向调节等生物过程， 且发挥抗炎活性与NF-κB、MAPK、PI3K-Akt 等信号通路有关。其中，NF-κB 是一条经典的与炎症密切相关的信号通路。在炎症过程中，NF-κB 通路能够激活iNOS，iNOS是一种重要的功能酶，可以促使细胞分泌大量的NO[20]。为了进一步明确QEO在发挥抗炎活性过程中与NF-κB 信号通路的相关性，研究使用RAW264.7 细胞的炎症模型进行验证。研究发现QEO在1～20 μg/mL 浓度范围对LPS 刺激的RAW264.7 细胞NO 具有极显著的抑制作用。为了验证上述结果，本研究对NO 荧光水平进行分析，发现QEO 在20 μg/mL 时能够显著降低细胞内的NO水平，表现出良好的抗炎活性。

此外，研究表明ROS会在细胞受到刺激后大量产生并激活NF-κB 信号通路，促进炎症相关基因的转录和表达[21]。为了进一步深入探究QEO的抗炎活性，本研究对RAW264.7 细胞中的ROS水平进行检测，结果发现QEO处理显著抑制了细胞氧化应激水平，减少了ROS 的表达量。NO水平的升高可以促使RAW264.7细胞分泌促炎因子TNF-α，而TNF-α 又可以调节IL-6 和IL-1β 细胞因子级联反应，使细胞损伤级联效应放大，加重炎症损伤[22]。因此，抑制炎症因子的过度释放是一种有效的抗炎方式。本研究发现QEO能够显著降低TNF-α、IL-6和IL-1β 等炎症因子的含量，且呈浓度依赖性。此前高小力等[23]的研究表明白木香精油能够显著抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞模型中炎症细胞因子IL-1β 和IL-6 的产生和释放，这与本研究中的QEO 发挥抗炎效果的方式一致。此外，本研究发现QEO 能够下调P65 和IκB-α蛋白的磷酸化水平，表示QEO具有使P65 和IκB-α的活化受到抑制的作用，说明QEO 能够通过抑制NF-κB 信号通路的激活，从而表现出良好的抗炎活性作用。

4结论

综上所述，QEO 的挥发性成分有2-（2-苯乙基）色酮、石竹素、绿叶烷、榄香醇、2-烯丙基-6-甲基苯酚等，且具有一定的抗氧化能力。生物信息学预测QEO 与炎症共有553 个交集靶点，且QEO发挥抗炎活性与MAPK、NF-κB、PI3K-Akt 等信号通路有关。此外，本研究揭示了QEO 能够显著抑制由LPS 诱导的过量ROS 的产生，抑制NF-κB信号通路的激活，进而抑制NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β 的大量产生，从而发挥抗炎活性的作用机制。本研究通过挥发性成分分析和分子细胞生物学的方法对QEO 的抗炎活性进行了阐释，为进一步开发和高效利用奇楠沉香资源提供理论基础。