基于响应面法对皇冠牡丹(Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’)增殖培养基大量元素配方的优化

收稿日期：2023-08-09

基金项目：国家自然科学基金项目（32001359）；南京林业大学大学生创新训练计划项目（2022NFUSPITP0436）

作者简介：李胜皓（1999-），女，重庆人，硕士研究生，研究方向为园林植物与观赏园艺。（E-mail）lynel1104@163.com

通讯作者：文书生，（E-mail）shusheng0507@126.com

摘要： 增殖系数低一直是制约牡丹微繁殖技术推广应用的障碍之一，但目前的研究多集中于植物生长调节剂的使用与组合，较少关注培养基配方对牡丹试管苗增殖效果的影响。本研究以皇冠牡丹（Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’）为试验材料，使用Design-Expert响应面法设计优化试验，探究WPM中5种大量元素[K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O]对皇冠牡丹试管苗增殖效果的影响，并建立数学模型分析预测最佳优化培养基配方。单因素效应分析结果表明，KH2PO4、NH4NO3与Ca（NO3）2·4H2O对牡丹试管苗的增殖效果有显著或极显著影响，而MgSO4·7H2O与K2SO4对牡丹试管苗的增殖效果无明显影响。交互作用分析结果表明，K2SO4与KH2PO4的交互作用对株高、茎长有显著或极显著影响，K2SO4与MgSO4·7H2O、KH2PO4与NH4NO3的交互作用对茎长有显著或极显著影响。根据试验数据构建模型进行分析预测，结果显示，5种大量元素优化配方为：K2SO4 2 257 mg/L、MgSO4·7H2O 907 mg/L、KH2PO4 481 mg/L、NH4NO3 200 mg/L与Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L。在该条件下开展验证试验，获得试管苗的增殖系数、株高、茎长与叶片数分别为2.43、4.62 cm、1.30 cm、6.75张，略高于Design-Expert试验得出的预测值，显著优于对照组，说明本研究成功优化了皇冠牡丹的专用增殖培养基配方。研究结果不仅能大幅提高皇冠牡丹的增殖效率，也为其他牡丹品种增殖培养体系的构建与改良提供重要的技术参考。

关键词： 牡丹；微繁殖；响应面法；增殖；WPM培养基

中图分类号： S685.11 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2024）08-1493-14

Optimization of macro-elements composition in the multiplication medium of Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’ based on response surface methodology

LI Shenghao， ZHANG Xiaozhi， PAN Yue， ZHENG Bingyan， WEN Shusheng

（College of Landscape Architecture， Nanjing Forestry University， Nanjing 210000， China）

Abstract： Low multiplication coefficient has been one of the obstacles limiting the industrial application of tree peony （Paeonia sect. Moutan） micropropagation technology， but most of the current studies have been focused on the use and combination of plant growth regulators， and less attention has been paid to the effect of medium formulation on the multiplication of test-tube seedlings of tree peony. In this study， we used Paeonia×lemoinei ‘Yellow CrowECVEQI0XsugZ00QQ/y8GO951BQ0uRBlPk+pQUPBaqNE=n’ as the experimental material and designed an optimization test by using Design-Expert response surface method to investigate the effects of five macro-elements， such as K2SO4， MgSO4·7H2O， KH2PO4， NH4NO3， Ca（NO3）2·4H2O in WPM medium on the multiplication effect of the test-tube seedlings of Paeonia sect. Moutan， and developed a mathematical model to predict the best optimized medium formulation. Results of single factor effect analysis showed that， KH2PO4， NH4NO3 and Ca（NO3）2·4H2O had significant or highly significant effects on the multiplication effect of the test-tube seedlings， while MgSO4·7H2O and K2SO4 had no significant effects. Results of interaction analysis showed that， the interaction between K2SO4 and KH2PO4 had significant or highly significant effects on plant height， and stem length， the interactions between K2SO4 and MgSO4·7H2O， KH2PO4 and NH4NO3 had significant or hightly significant effects on stem length. Based on the experimental data， the model analysis results predicted that the optimized formulations for five macro-elements were K2SO4 2 257 mg/L， MgSO4·7H2O 907 mg/L， KH2PO4 481 mg/L， NH4NO3 200 mg/L and Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L. The validation test was conducted， and the multiplication coefficient， plant height， stem length and leaf number of the test-tube seedlings were 2.43， 4.62 cm， 1.30 cm and 6.75 respectively， which were slightly higher than the predicted values obtained by Design-Expert experiment and were significantly better than the control group， indicating the special multiplication medium for P.×lemoinei ‘Yellow Crown’ was constructed successfully. The results of this study can not only greatly improve the multiplication efficiency of P.×lemoinei ‘Yellow Crown’， but can also provide an important technical reference for the construction and improvement of multiplication culture system of other tree peony species.

Key words： tree peony;micropropagation;response surface method;multiplication;WPM medium

牡丹（Paeonia sect. Moutan）为芍药科芍药属落叶灌木，是原产于中国的传统名花和药用植物，近年来被发现作为新型油料植物也有巨大的市场潜力[1]。皇冠牡丹（P.×lemoinei ‘Yellow Crown’）为20世纪70年代由日本育种学家选育的牡丹远缘杂交品种，花乳黄色，花头直立，芳香馥郁，生长势强，品质优良，具有很高的观赏与经济价值。但长期以来该品种的传统繁殖方式（如分株、嫁接等）存在繁殖系数低、周期长、易受环境条件限制等问题，严重制约了其规模化生产。微繁殖技术即植物的离体无性繁殖技术，在保留母株优良性状的同时，具有繁殖快速、繁殖系数高等特点，能弥补传统繁殖方法的不足，因此，构建皇冠牡丹的微繁殖技术体系是推动其规模化生产的必然趋势。

增殖培养是牡丹微繁殖技术的第2个阶段，其中试管苗能否高效地增殖和正常生长是决定微繁殖技术成败的关键。国内自1984年首次开展牡丹微繁殖技术研究以来[2]，迄今已初步建立了菱花湛露（P. suffruticosa‘Ling Hua Zhan Lu’）、洛阳红（P.×suffruticosa‘Luo Yang Hong’）、正午S9Weqz4lRk5OmoyZwW1O2Q==（P.×lemoinei ‘High Noon’）等40多个牡丹品种的增殖培养体系[3]。但目前关于皇冠牡丹增殖培养体系的研究仍鲜见报道，仅黄素姣[4]就植物生长调节剂对皇冠牡丹增殖生长的影响进行了探究，并获得了适合皇冠牡丹增殖的植物生长调节剂组合，即6-BA（6-苄氨基嘌呤） 0.20mg/L+GA3（赤霉素） 0.10mg/L+ZT（玉米素） 0.05mg/L，但并未探究培养基中基础成分对其增殖效果的影响。此外，已有研究发现牡丹增殖培养过程中的培养基成分与试管苗增殖效果关系密切，如Beruto等[5]发现，培养基中的Ca2+浓度会对试管苗产生影响，并且提高WPM（木本植物专用培养基）中的Ca2+浓度，不仅能有效减少顶芽坏死的现象，还能提高增殖系数和茎长[6]；Li等[7]则发现降低培养基中NH+4与NO-3浓度的比值可以促进试管苗的生长，并降低试管苗玻璃化率；在此基础上，有研究将WPM中Ca（NO3）2浓度分别提高至原始浓度的3.0倍与4.0倍，从而显著提高了正午牡丹（P.×lemoinei ‘High noon’）和凤丹牡丹（P. ostii）试管苗的增殖系数，且子代腋芽较为粗壮，而Ca（NO3）2浓度过低会导致试管苗生长不良、易玻璃化，Ca（NO3）2浓度过高则会降低增殖系数，使叶片变小卷曲[8-9]。综上，前人关于牡丹增殖培养阶段的研究多集中在植物生长调节剂的筛选，较少对培养基配方进行研究，且培养基构成组分复杂，各因素间会产生相互作用，使用常规试验方法将耗费大量时间和精力。

响应面分析法（RSM）通过结合数学方法和统计分析，对响应过程变量进行数学建模和分析，寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计学方法[10]，主要利用二次回归模型对各因素和响应值之间的关系进行分析和拟合，试验精度高、次数少、周期短，克服了正交试验与单因素试验法的不足，已被广泛应用于食品学、生态学等领域，并常被用来改良植物组织培养过程中培养基成分与培养条件[11-14]。在牡丹微繁殖技术研究中，响应面法也有应用，黄弄璋[15]使用响应面法中的Plackett-Burman试验，以WPM中的大量元素、微量元素、肌醇、钙、有机物质、铁盐6大组分进行设计，筛选发现铁盐、钙和肌醇是影响正午牡丹增殖效果的主要影响因子，并选取这3个因素设计Box-Behnken（效应面法）试验对培养基进行优化，将增殖系数提高了10%左右。这表明响应面法在牡丹微繁殖技术培养基配方改良中具有较大的应用潜力，但目前尚未见使用响应面法对牡丹微繁殖技术培养基中的大量元素浓度进行改良调整的研究。鉴于此，本研究拟以皇冠牡丹试管苗为试验材料，利用响应面法对WPM中5种大量元素配方进行优化，以期筛选获得适宜皇冠牡丹的特定增殖培养基，为该品种规模化生产提供技术支持，并为其他牡丹品种微繁殖技术的研发提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022年2月底于山东省菏泽市古韵牡丹基地进行，选取长势良好、无病虫害的皇冠牡丹母株，剪取带有饱满鳞芽的枝，剥下腋芽作为外植体，并按照文献[16]的方法对外植体进行消毒后进行接种，启动培养基为改良WPM[Ca（NO3）2·4H2O 1 668 mg/L+BA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，附加蔗糖30.0 g/L、琼脂6.5 g/L，pH=5.9]，后续如无特殊说明，培养基同上。在第5次继代培养末期，切取芽丛上茎长约为1～2 cm的健壮单芽，去除全部叶片作为试验材料。

1.2 试验方法

以WPM中5种大量元素的无机盐[K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O]作为设计因素，前4种大量元素的无机盐（K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3）的浓度范围设置为WPM原浓度[K2SO4为990 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为170 mg/L，NH4NO3为400 mg/L，Ca（NO3）2·4H2O为556 mg/L]的0.5～3.0倍，Ca（NO3）2·4H2O的浓度范围设置为WPM原浓度的0.5～4.0倍，使用Design-Expert Optimal软件中的响应面法进行最佳优化试验设计，得到30个处理，并以WPM原浓度作为对照（表1）。上述各处理培养基均附加6-BA 0.5 mg/L、GA3 0.1 mg/L、蔗糖30.0 g/L、琼脂6.5 g/L，pH 5.9。

1.3 培养条件与数据统计分析

本研究中启动和增殖培养条件均为培养温度（24±1） ℃，光照时间14 h/d，荧光灯光照度为32.4 μmol/（m2·s）。

增殖培养50 d后，统计不同处理试管苗的增殖系数（茎长为1～2 cm健壮单芽数/接种外植体个数）、株高、茎长和叶片数，并以上述指标为目标函数建立模型，根据模型计算预测目标值对应各因素的置信区间，获得优化配方，从而确定优化培养基的组成比例，并进行验证试验。

2 结果与分析

将原始数据导入SPSS22.0，可得增殖系数、平均株高、平均茎长与单株叶片数（表2）。由表2可知，增殖系数较高的前3个处理依次为第13组、第28组、第15组；平均株高较高的前3个处理依次为第19组、第28组、第6组；平均茎长较高的前3个处理依次为第28组、第15组、第14组；单株叶片数较高的前3个处理依次为第15组、第19组、第13组。综合来看，第28组为最优处理，其增殖系数、平均株高、平均茎长与单株叶片数均优于对照，说明培养基大量元素浓度对试管苗增殖效果会产生显著影响。

将SPSS22.0处理后的数据通过软件Design-Expert 12.0进行数据拟合和显著性检验，对试验结果与试验因子进行三维建模，预测增殖系数和平均茎长处于较高水平时培养基成分的最优配比。其中，5项变量因子为K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O的浓度倍数，分别用x1、x2、x3、x4、x5表示。线性项显著表示该大量元素浓度对响应值影响显著，二次项显著表示2种大量元素浓度交互作用显著，系数为正、负分别表示浓度增大时影响方向的正、负。

2.1 平均增殖系数模型建立与分析

以增殖系数为Y1，根据Design-Expert 12.0软件拟合试验处理，得到增殖系数的二次回归方程：

Y1=1.414 280+0.001 072x1-0.030 090x2+0.398 823x3-0.016 274x4+0.224 442x5+0.037 415x1x2+0.035 269x1x3+0.036 119x1x4-0.019 207x1x5+0.016 060x2x3-0.049 592x2x4-0.002 236x2x5-0.024 230x3x4+0.022 937x3x5-0.002 875x4x5-0.038 994x21+0.001 120x22-0.113 775x23-0.003 998x24-0.035 254x25。

分析结果（表3）表明，线性项x3、x4对增殖系数具有极显著影响，线性项x5对增殖系数具有显著影响，由F（x3）>F（x4）>F（x5）>F（x2）>F（x1）可知，5种大量元素浓度对增殖系数的影响程度为KH2PO4>NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>MgSO4·7H2O>K2SO4。具体影响（图1）如下： KH2PO4、Ca（NO3）2·4H2O浓度倍数与增殖系数呈线性正相关（图1C；图1E），相关系数分别为0.398 823与0.224 442；NH4NO3浓度倍数与增殖系数呈线性负相关（图1D），相关系数为-0.016 274；K2SO4、MgSO4·7H2O浓度倍数与增殖系数无显著相关性（图1A、图1B）。

取F值＞1.5的二元二次项分析各因素间的交互作用与对应响应曲面（图2）。比较F值大小可知，x1x2、x1x3、x1xiQpEOpm0Pdu9NRAwmbSco02ONOfP4j2cipENJgXQAQY=4和x2x4这4项对增殖系数的影响程度为：x2x4＞x1x3＞x1x4＞x1x2（表3），即MgSO4·7H2O与NH4NO3的交互作用＞K2SO4与KH2PO4的交互作用＞K2SO4与NH4NO3的交互作用＞K2SO4与MgSO4·7H2O的交互作用。影响如下：（1）K2SO4与MgSO4·7H2O浓度比保持为1∶1时，试管苗增殖系数未见明显变化；但低浓度K2SO4与高浓度MgSO4·7H2O相互作用会导致增殖系数下降（图2A）。（2）K2SO4与KH2PO4浓度同时升高，增殖系数先上升后下降，且增殖系数受KH2PO4浓度影响较大（图2B）。（3）K2SO4与NH4NO3两者浓度同时升高，增殖系数逐渐下降且受NH4NO3浓度影响较大；低浓度NH4NO3可以使增殖系数保持较高水平（图2C）。（4）当MgSO4·7H2O与NH4NO3浓度同时升高时，试管苗增殖系数逐渐降低，而高浓度MgSO4·7H2O与低浓度NH4NO3相互作用时增殖系数可达最高值（图2D）。

2.2 平均株高模型建立与分析

以平均株高为Y2，根据Design-Expert 12.0软件拟合试验处理，得到株高的二次回归方程：

Y2=2.998 730-0.263 603x1+0.588 062x2+0.264 487x3-0.161 580x4+0.462 537x5-0.007 257x1x2+0.135 470x1x3+0.037 222x1x4-0.031 871x1x5+0.097 298x2x3-0.021 955x2x4-0.046 501x2x5-0.119 603x3x4-0.031 871x3x5-0.042 601x4x5-0.027 184x21-0.178 435x22-0.053 012x23+0.028 309x24+0.000 039x25。

分析结果（表4）表明，线性项x3、x4、x5对株高均有极显著影响，二次项x1x3对株高有显著影响。由F（x4）>F（x5）>F（x3）>F（x1）>F（x2）可知，5种大量元素浓度对平均株高的影响程度为NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>KH2PO4>K2SO4>MgSO4·7H2O。具体影响如下：（1）KH2PO4、Ca（NO3）2·4H2O浓度倍数与株高呈线性正相关（图3C；图3E），相关系数分别为0.264 487与0.462 537；NH4NO3浓度倍数与株高呈线性负相关，相关系数为-0.161 580（图3D）；K2SO4与MgSO4·7H2O浓度倍数与株高无显著相关性（图3A、图3B）。（2）K2SO4与KH2PO4浓度倍数的交互作用与株高呈线性正相关（图3F），相关系数为0.135 470。

取F值＞1.0的二元二次项分析交互作用与响应曲面。比较F值大小可知，x1x3、x2x3、x2x5和x3x4这4项对株高的影响程度为：x1x3＞x3x4＞x2x3＞x2x5（表4），即K2SO4与KH2PO4的交互作用＞KH2PO4与NH4NO3的交互作用＞MgSO4·7H2O与KH2PO4的交互作用＞MgSO4·7H2O与Ca（NO3）2·4H2O的交互作用。影响如下：（1）当K2SO4与KH2PO4浓度同时升高时，株高无明显变化，当K2SO4浓度较高且KH2PO4浓度较低时，株高呈下降趋势（图4A）。（2）当MgSO4·7H2O浓度倍数为0.5～1.8倍时，株高随KH2PO4浓度升高而上升；当浓度倍数在1.8～3.0倍时，株高随KH2PO4浓度升高而下降（图4B）。（3）MgSO4·7H2O浓度倍数在0.5～2.0倍时，株高随Ca（NO3）2·4H2O浓度升高而上升；当浓度倍数在2.0～3.0倍时，株高随Ca（NO3）2·4H2O浓度升高而下降（图4C）。（4）当KH2PO4浓度升高、NH4NO3浓度下降时，株高呈上升趋势并在KH2PO4浓度倍数为3.0倍、NH4NO3浓度倍数为0.5倍时达到最高值（图4D）。

2.3 平均茎长模型建立与分析

以平均茎长为Y3，根据Design-Expert 12.0软件拟合试验处理，得到茎长的二次回归方程：

Y3=1.301 670+0.148 644x1-0.196 973x2+0.071 288x3-0.193 460x4+0.116 001x5+0.060 904x1x2+0.062 311x1x3+0.005 765x1x4+0.009 485x1x5+0.020 522x2x3-0.023 159x2x4+0.021 980x2x5-0.050 456x3x4+0.023 133x3x5+0.002 436x4x5-0.027 867x12+0.008 299x22-0.028 877x32-0.035 352x42-0.042 483x52。

分析结果（表5）表明，线性项x3、二次项x1x2和x1x3对平均茎长具有极显著影响，线性项x4、二次项x3x4、x25对茎长具有显著影响。由F（x3）>F（x4）>F（x5）>F（x2）>F（x1）可知，5种大量元素浓度对平均茎长的影响程度为KH2PO4>NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>MgSO4·7H2O>K2SO4。具体影响如下：（1）KH2PO4浓度倍数与茎长呈正线性相关（图5C），相关系数为0.071 288；NH4NO3浓度倍数与茎长呈负线性相关（图5D），相关系数为-0.193 460；K2SO4、MgSO4·7H2O浓度倍数与茎长无显著相关性（图5A、图5B）。（2）K2SO4与MgSO4·7H2O浓度倍数的交互作用与茎长呈正线性相关（图5F），相关系数为0.060 904；K2SO4与KH2PO4浓度倍数的交互作用与茎长呈正线性相关（图5G），相关系数为0.062 311；NH4NO3与KH2PO4浓度倍数的交互作用与茎长呈负线性相关（图5H），相关系数为-0.050 456。（3）Ca（NO3）2·4H2O浓度倍数对茎长无显著影响（图5E），但其平方值对茎长具有显著影响，相关系数为-0.042 483，茎长随Ca（NO3）2·4H2O浓度倍数增大呈现先上升后下降的趋势。

取F值＞3.0的二元二次项分析交互作用与响应曲面。比较F值大小可知，x1x2、x1x3、x3x4和x3x5这4项交互作用对茎长的影响程度顺序为：x1x3＞x1x2＞x3x4＞x3x5，即K2SO4与KH2PO4的交互作用＞K2SO4与MgSO4·7H2O的交互作用＞KH2PO4与NH4NO3的交互作用＞KH2PO4与Ca（NO3）2·4H2O的交互作用。具体影响如下：（1）K2SO4与MgSO4·7H2O浓度为1∶1且同时升高时，茎长先下降后升高（图6A）。（2）K2SO4与KH2PO4浓度同时增加时，茎长上升，在两者同时达到3.0倍时茎长达到最高值（图6B）。（3）KH2PO4与NH4NO3浓度同时升高时，茎长先升高后下降；当KH2PO4处于高浓度且NH4NO3处于低浓度时，试管苗茎长最高（图6C）。（4）KH2PO4与Ca（NO3）2·4H2O浓度同时升高时，茎长随之升高；当KH2PO4浓度较高且Ca（NO3）2·4H2O浓度倍数约为3.0倍时，茎长达到最高值（图6D）。

2.4 WPM中的5种大量元素配方优化及验证

通过Design-Expert 12.0建立模型，将皇冠牡丹试管苗增殖系数目标设为max，重要程度为5（+++++）；茎长目标设为max，重要程度为4（++++）；株高目标设为max，重要程度为3（+++）；叶片数目标设为max，重要程度为2（++）。根据模型分析结果，可得出适宜皇冠牡丹增殖培养的WPM中的5种大量元素的最佳浓度倍数分别为x1=2.28、x2=2.45、x3=2.83、x4=0.50、x5=3.53，即K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3与Ca（NO3）2·4H2O的质量浓度分别为2 257 mg/L、907 mg/L、481 mg/L、200 mg/L与1 963 mg/L，此时培养基中离子浓度分别为NO-3 19.13 mmol/L，NH+4 2.50 mmol/L，Ca2+ 8.31 mmol/L，K+ 29.44 mmol/L，Mg2+ 3.68 mmol/L，PO3-4 3.53 mmol/L，SO2-4 16.63 mmol/L，并通过模型预测出在该条件下皇冠牡丹的增殖系数、株高、茎长与单株叶片数分别为2.24、4.32 cm、1.64 cm、5.31张。使用该配方进行验证试验（图7），得到皇冠牡丹的增殖系数、株高、茎长与单株叶片数分别为2.43、4.62 cm、1.30 cm、6.75张，除茎长稍低外，其余指标均高于预测值，并显著优于对照组（1.80、3.84 cm、1.32 cm、4.32张），这说明该模型可信，本研究得出的5种大量元素的最佳浓度可以用于皇冠牡丹的增殖培养。

3 讨论

3.1 单因素条件对皇冠牡丹增殖和生长的影响

在对植物进行离体培养时，植物生长发育所需养分主要来源于培养基，基本培养基的成分与浓度对植物有重要影响[17]。本研究结果表明，WPM中的5种大量组分中，KH2PO4、NH4NO3与Ca（NO3）2·4H2O对牡丹试管苗的增殖效果有显著或极显著影响，而MgSO4·7H2O与K2SO4对牡丹试管苗的增殖效果无明显影响。

KH2PO4可同时为植物提供磷、钾2种大量元素，在WPM、MS与DKW等植物培养基中均有添加，增加KH2PO4用量会促进植物生物量的累积[18]。本研究发现，随着KH2PO4浓度上升，试管苗的增殖系数、株高与茎长明显提高，481 mg/L（2.83倍）KH2PO4为皇冠牡丹试管苗增殖最适浓度，而高浓度KH2PO4虽然会促进牡丹试管苗株高与茎长增加，但同时会降低增殖系数与叶片数。多数研究结果表明，不同植物适宜的KH2PO4浓度差异显著，苹果矮化砧木SH6继代培养的最适浓度为175 mg/L[19]，杏（Prunus armeniaca）试管苗培养的最适KH2PO4浓度为125 mg/L[12]，而油松（Pinus tabuliformis）成熟离体胚不定芽诱导所需最适KH2PO4浓度为340 mg/L[20]。此外，同种植物的不同品种适宜的KH2PO4浓度也存在较大差异，如在使用MS的基础上，KH2PO4浓度对白鹤芋属（Spathiphyllum）不同品种增殖系数的影响存在差异[21]。因此，皇冠牡丹试管苗增殖阶段的最佳KH2PO4质量浓度为481 mg/L（2.83倍），但对于其他牡丹品种还需要根据实际情况具体分析。

钙元素在细胞分裂、细胞壁形成和分生组织生长过程中是非常重要的[22]，前人研究发现高浓度Ca2+对牡丹试管苗的增殖效果有促进作用，将MS培养基中CaCl2浓度提升至原浓度的2倍可显著提高Mme de Vatry牡丹试管苗的增殖系数，并减轻茎尖坏死和玻璃化程度[6]。然而，不同牡丹品种的最适钙盐浓度具有较大差异，同样以WPM作为增殖培养基，正午牡丹的最适Ca（NO3）2·4H2O浓度为1 668 mg/L（3.00倍），此时试管苗的增殖系数可达到3.0，子代腋芽较为粗壮[8]；而凤丹牡丹的最适Ca（NO3）2浓度为1 544 mg/L（4.00倍），此时增殖系数可达3.07[9]，这可能是由牡丹品种间基因型不同所致。本研究发现，随着Ca（NO3）2·4H2O浓度升高，皇冠牡丹试管苗的增殖系数与茎长呈先升高后下降的趋势，而株高则持续上升，最佳Ca（NO3）2·4H2O质量浓度为1 963 mg/L（3.53倍），在该条件下试管苗较为健壮，分枝与茎叶数量较对照显著提高，且茎尖坏死现象得到有效缓解，与前人研究结果一致。因此，在一定范围内提高WPM中Ca（NO3）2·4H2O浓度是提高牡丹试管苗增殖效果的有效途径，而其具体的作用机理也值得后续研究深入探索。

3.2 交互作用对皇冠牡丹试管苗有增殖和生长的影响

本研究结果显示，K2SO4与KH2PO4、K2SO4与MgSO4·7H2O、KH2PO4与NH4NO3的交互作用对试管苗增殖效果影响显著或极显著。因电荷存在动态平衡，培养基中大量元素间的交互作用实则为离子间的交互作用[23]，因此本研究以分析离子间的交互作用与元素对植物的影响为主。

K2SO4与KH2PO4的交互作用对株高、茎长均有显著或极显著影响，当二者浓度同时增大时，增殖系数呈先升高后下降的趋势，株高与茎长呈升高趋势。因二者的阳离子相同，其交互作用实则为SO2-4与PO3-4间的交互作用，SO2-4提供硫元素，含硫氨基酸不仅是构成蛋白质的主要成分，还是细胞内某些化合物合成的介质之一[24]；PO3-4提供磷元素，磷是植物必需的大量元素，参与磷脂、核酸、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和辅酶等大分子合成[25]。已有研究结果表明，施磷能显著提高牡丹植株叶片的叶绿素含量并促进光合作用[26]，而硫是植物光合作用过程中的重要组分，二者均与光合作用有关；Misson等[27]发现，在低磷环境下植物会加大对硫酸盐的吸收转运以合成硫脂，而硫脂可以在一定程度上代替磷脂，说明硫、磷元素在功能上存在重叠性，存在相互影响。目前关于SO2-4与PO3-4在植物体内的交互作用尚未见报道，但从本研究结果可以看出二者存在协同的交互作用，适宜的SO2-4与PO3-4浓度比会促进试管苗的增殖。但本研究也发现，当二者浓度同时超过2.50倍后，增殖系数与叶片数会出现下降趋势，这可能是过高的离子浓度对植物产生了毒害作用。因此，在提高培养基内营养物质浓度以促进试管苗增殖的过程中，应注意保持培养基中离子浓度平衡，避免过高的浓度对植物生长产生负面影响。

本研究结果显示，K2SO4与MgSO4·7H2O的交互作用对茎长有极显著影响，当两者浓度同时上升时，茎长呈先下降后上升的趋势。已有研究结果表明钾元素与镁元素存在交互作用，高浓度钾会抑制植物对镁的吸收，并导致植物因缺镁而生长不良[28]。这可能与二者相似的化学性质产生的拮抗作用有关[29]，而对细胞膜上相同转运蛋白的竞争是二者产生拮抗作用的主要原因[30]，且钾、镁间的交互作用会影响植物对其他养分如氮、磷、钙等的积累[31-32]。本研究中当K2SO4与MgSO4·7H2O浓度倍数介于0.5～2.0时，茎长呈下降趋势，这与前人研究发现的钾、镁元素间的拮抗作用相符合；而当二者浓度倍数大于2.0后，茎长呈上升趋势，这可能是由于更高浓度的钾、镁元素能抵消一部分拮抗作用对试管苗产生的负面影响。因此，在改良培养基中大量元素配方时应重视矿质元素间的平衡关系，尽量避免钾、镁元素间产生拮抗作用，而关于钾、镁元素在牡丹体内的作用机理则需要进一步研究。

本研究结果显示，KH2PO4与NH4NO3间的交互作用对茎长有显著影响，当KH2PO4浓度上升、NH4NO3浓度下降时，茎长呈升高趋势。前人研究发现植物对二者需求的差异可能与基因型、统计方式和使用浓度范围有关[33-35]。Akin等[11]在对榛子（Corylus heterophylla）所使用的DKW培养基中的离子浓度进行响应面法优化时也发现相似情况，即当KH2PO4为高浓度、NH4NO3为低浓度时，榛子Wepster能得到较高的芽质量，榛子Dorris和Wepster能达到理想芽长。这可能是由于NH4NO3与KH2PO4在产生交互作用时，随着两者浓度升高，NH4NO3与Ca（NO3）2·4H2O同时产生了反应，而Ca（NO3）2·4H2O和NH4NO3同时为试管苗提供氮元素，降低NH4+与NO-3比值能够显著促进牡丹试管苗增殖[7-9]，本研究据此优化得出结果，将NH4NO3浓度降低为基本WPM中浓度的0.50倍后，增殖效果得到显著提升，与前人研究结果相似。

3.3 铵态氮（NH+4-N）和硝态氮（NO-3-N）浓度比值对皇冠牡丹增殖的影响

氮是植物生长过程中需求量最大的矿质元素，是组成蛋白质和核酸的必要成分。WPM为木本植物专用培养基[36]，供给植物的主要氮源为铵态氮（NH+4-N）和硝态氮（NO-3-N），其中NH4NO3提供NH+4-N，NH4NO3和Ca（NO3）2·4H2O共同提供NO-3-N。二者虽共同提供氮元素，但对植物生长的作用存在差异，关于培养基中NH+4-N与NO-3-N的浓度比值对试管苗增殖效果的影响已有诸多研究报道，结果显示，较低的NH+4-N与NO-3-N的浓度比会促进试管苗的增殖与生长[11， 37-40]。在牡丹研究中也发现类似现象，例如Li等[7]通过降低MS培养基中NH+4-N与NO-3-N浓度比值以促进牡丹试管苗增殖，而后有试验通过增加培养基中Ca（NO3）2·4H2O浓度，在NH+4-N与NO-3-N的浓度比值降低的同时提高培养基中Ca2+的浓度，显著提高了牡丹试管苗的增殖效果[8-9]。这表明降低培养基中NH+4-N与NO-3-N的浓度比值有利于牡丹试管苗的增殖，这可能是由于高浓度NH4+会促进植物吸收过多水分，从而导致试管苗枝条坏死、存活率降低[40-41]，同时较低的NH+4-N与NO-3-N的浓度比值可以更好地缓冲培养基的pH，减少培养基pH波动对试管苗的影响[42]。本研究也得到类似结果，将Ca（NO3）2·4H2O浓度提升至3.50倍，NH4NO3降低至0.50倍后，试管苗增殖系数得到显著提升，并且茎尖坏死现象得到缓解。综上可见，WPM中原有的NH+4-N与NO-3-N的浓度比值无法满足牡丹试管苗的增殖需要，在一定范围内提高培养基中Ca（NO3）2·4H2O浓度并降低NH4NO3浓度，是促进皇冠牡丹试管苗增殖生长的有效途径。当然，不同牡丹品种的适宜浓度存在较大差异，关于NH+4-N与NO-3-N的浓度比值对牡丹试管苗产生影响的机理研究还尚在探索阶段，还需进一步研究。

4 结论

本研究基于响应面法，优化得到皇冠牡丹增殖培养专用WPM大量元素配方[K2SO4 2 257 mg/L、MgSO4·7H2O 907 mg/L、KH2PO4 481 mg/L、NH4NO3 200 mg/L、Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L]，建立了高效的皇冠牡丹增殖培养体系，在该条件下试管苗的增殖效率（增殖系数2.43、株高4.62 cm、茎长1.30 cm、叶片数6.75张）得到显著提高。

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（责任编辑：陈海霞）